最新耐酸高温淀粉酶菌株的基因诱变和筛选.教学讲义ppt课件.ppt

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1、耐酸高温淀粉酶菌株的基因诱变和筛选.耐酸高温淀粉酶菌株的基因诱变和筛选文献综述研究目的与意义实验结果总结与讨论高温淀粉酶的用途：啤酒酿造制造味精制糖工业活性污泥处理纺织退浆基因诱变和筛选耐酸高温淀粉酶基因的意义天然α-淀粉酶作用的pH范围一般为6.0~7.0，即pH在中性条件下，但是在生产生活中常常要求α-淀粉酶在偏酸性（5.2~5.6）条件下工作，因此要求重新构建耐酸高温淀粉酶菌株，使该菌株生产的α-淀粉酶适应酸性条件并能以高活性水解淀粉。不同淀粉酶样品的凝胶电泳结果将野生型淀粉酶与诺维信公司的耐酸性淀粉酶产品

2、进行SDS-PAGE比较，结果发现：蛋白质分子量大小相近，因此，影响pH稳定性的主要因素为基因的不同。SDS蛋白质电泳123456789实验流程图载体PEASYTM-T3与ATCC14580地衣杆菌高温淀粉酶基因进行DNA重组转化进入大肠杆菌感受态细胞大提重组质粒亚硝酸钠诱变并转化、培养小提质粒，琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小。DNA纯化，保存遗传物质基因测序含有重组载体的大肠杆菌进行甘油保菌处理重组载体转化进入地衣杆菌在不同的低pH值LB培养基上筛选实验结果PEASYTM-T3载体与ATCC14580地衣杆菌的淀粉

3、酶基因进行重组后转入大肠杆菌感受态细胞中并培养大肠杆菌感受态细胞，对大肠杆菌进行大提质粒，进行琼脂糖凝胶电泳。重组载体pEASY-T3-amyl3.0kb2.0kbpEASY-T3-amyl1kbmarkerpEASY-T3-amyl重组载体pEASY-T3-amyl，经过亚硝酸钠诱变处理（15分钟和80分钟）并转化进入大肠杆菌感受态细胞培养，对大肠杆菌进行大提质粒。将提取出的遗传物质进行琼脂糖凝胶电泳。3.0kb2.0kbpEASY-T3-amylM151kbMarkerpEASY-T3-amylM80亚硝酸钠

4、诱变的重组质粒pEASY-T3-amylM实验结果实验结果含有未诱变质粒pEASY-T3-amyl的大肠杆菌在pH为5.6的LB培养基上生长，但无透明圈，无耐酸淀粉酶活性。实验结果含有pEASY-T3-amylM15的大肠杆菌，在pH为5.6的LB培养基上生长，产生的淀粉酶有耐酸淀粉酶活性。实验结果含有pEASY-T3-amylM80的大肠杆菌，在pH为5.6的LB培养基上生长，产生的淀粉酶有耐酸淀粉酶活性。正向突变株的氨基酸序列分析pEASY-T3-amylM15经测序发现共有7点突变：第一点、第二点在信号肽内

5、，无明显意义。第三点：第4位：K→N赖氨酸（碱性）→天冬酰胺（中性）第四点：第134位：R→L精氨酸（碱性）→亮氨酸（中性）第五点：第288位：N→D天冬酰胺（中性）→天冬氨酸（酸性）有意义，影响大肠杆菌在低pH条件下产生淀粉酶。第六点：第289位：F→Y苯丙氨酸→酪氨酸（多一个羟基）第七点：第320位：A→S丙氨酸→丝氨酸（多一个羟基）活性位点位于142、145、148处的His-X-Y-Gly-Z-W–Ser正向突变株的氨基酸序列分析2.pEASY-T3-amylM80经测序发现也有7点突变且与pEASY-T

6、3-amylM15的7点突变一致。结论通过亚硝酸钠诱变技术，得到了含有有益氨基酸突变的（K4N，R134L，N288D，F289Y，A320S）的高温淀粉酶；含有突变的amyl基因的重组大肠杆菌能够在pH5.6的条件下产生高温淀粉酶并显示出酶活。讨论与建议亚硝酸钠作为诱变剂，可以使遗传物质发生突变。如果需要增加突变率，可以适当提高亚硝酸钠的浓度。改良诱变剂激光与亚硝酸钠结合：激光诱变具有操作简单、安全、变异率高、辐射损伤轻等优点。而激光与亚硝酸钠诱变剂的复合处理也具有潜在的诱人的诱变效果。微波与亚硝酸钠结合：微波

7、与亚硝酸钠诱变剂结合，会导致大肠杆菌对数期的变异率比稳定期高，霉菌萌发孢子的变异率低于未萌发孢子，原核生物的诱变率高于真核生物。定点突变，通过蛋白质结构分析，进行理性设计及突变，筛选改良基因。谢谢常见急危重症的快速识别要点与处理技巧深圳市急救中心科教培训部赵伟医生二00八年十一月20一、常见急危重症的范畴21急危重症通常指病人的脏器功能衰竭，包括“六衰”；衰竭的脏器数目越多，说明病情越危重（两个以上称“多脏器功能衰竭”），而最危重的情况莫过于心跳骤停。1、脑功能衰竭：如昏迷、中风、脑水肿、脑疝形成、严重脑挫裂伤

8、、脑死亡等。222、各种休克：由于各种原因所引起的循环功能衰竭，最终共同表现为有效血容量减少、组织灌注不足、细胞代谢紊乱和功能受损的一组综合征。休克的常见病因，可分为创伤性、失血性、失液性、感染性、心源性、过敏性、神经源性和内分泌性等类型。233、呼吸衰竭：包括急性与慢性呼吸衰竭，根据血气分析结果又可分为Ⅰ型呼衰（单纯低氧血症）、Ⅱ型呼衰（同时伴有二氧化碳潴留）。4、心力