实训十二微生物鉴定中常用的生理生化试验.doc

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1、实训十二微生物鉴定中常用的生理生化试验一、实验目的1。证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2。掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。4。掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。5.了解MＲ的原理.二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同,因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌,尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下：1。淀粉水解试验:在淀粉固体培养基上接种四种细菌(

2、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）,培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。3.甲基红试验（MR):某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸,乙酸和乳酸等多种有机酸,是培养液PH值降至4.2以下，加入

3、甲基红后溶液呈红色。三、实验材料1。菌种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等.2.培养基固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支,附德汉式小管），葡萄糖蛋白胨水培养基。3.溶液和试剂革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。4。仪器和其他用品平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙,标签纸，酒精灯，滴管。四、实验步骤1.制备培养基制备固体淀粉培养基，固体油脂培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖培养基（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基.2。淀粉水解试验(1）将固体淀粉培养

4、基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。（2）用记号笔在平板底部划成4部分.（3）将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等分别在不同的部分点种，在平板的反面分别在4部分写上菌名.（4)将平板倒置在37℃温箱中培养48h。（5)观察各种细菌的生长情况,打开平板盖子，滴入少量卢氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解,为阳性.透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱,即产生胞外淀粉酶活力的高低。3糖发酵试验（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支,分别接入大肠

5、杆菌等，第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支,同样分别接入大肠杆菌等，第三支不接种，作为对照。在接种后,轻缓摇动试管，使均匀，防止倒置的小管进入气泡。（3）将接过种和作为对照的6支试管均置37℃中培养48h.（4）观察各试管颜色变化及徳汉氏小管中有无气泡。4甲基红试验（1）用接种针将大肠杆菌等分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃中培养48h。（2)培养48h后,将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。五、实验结果1。大分子物质的水解试验“+”表示阳性,可以水解，“—"表示阴性，不可以水解2。

6、糖发酵试验“+”表示产酸或产气，“—”表示不产酸不产气3.甲基红试验“+"表示变红，“—”表示变黄六、思考题1．你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？2．假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果?