番茄红素对心肌细胞缺氧损伤作用机制

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1、番茄红素对心肌细胞缺氧损伤作用机制　　[摘要]目的探讨番茄红素对心肌细胞沉默信息调节因子1（Sirt1）-自噬通路的作用。方法原代培养乳鼠心肌细胞予以无血清、无糖培养及缺氧干预，模拟心肌缺血，用番茄红素和Sirt1的抑制剂尼克酰胺干预。采用Westernblot法检测Sirt1、自噬相关基因6（Atg6）Beclin1及自噬相关基因8LC3蛋白的表达；RT-PCR技术检测心肌细胞Sirt1的mRNA表达。结果①在心肌缺氧中，番茄红素提高了细胞Sirt1蛋白和mRNA的表达水平；②番茄红素增加了心肌缺氧时自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白的表达；③Sirt1的抑制剂尼

2、克酰胺阻断了番茄红素对自噬蛋白的作用。结论番茄红素可能通过Sirt1激活自噬，从而减少心肌缺氧损伤。[关键词]心肌细胞；缺氧；番茄红素；沉默信息调节因子1；尼克酰胺；自噬相关基因[中图分类号]R-33[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2013）10（c）-0007-047番茄红素（lycopene，Lyc）是一种天然生物色素，属于类胡萝卜素一族，富含于番茄、石榴、木瓜等红色水果和蔬菜中。目前国内外大量的研究证明番茄红素不仅有极强的抗氧化力，还有抑制炎症因子表达、抗癌，预防衰老等多种生物学效应[1-2]。近年有少量关于番茄红素防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制

3、动脉粥样硬化的报道[3-4]，但关于其作用机制的研究甚少。因此探索其内在机制，寻找有效的治疗靶点具有重要的临床实践意义。沉默信息调节因子1（silentinformationregulator1，Sirt1）是机体调节能量代谢的重要因子，它通过对组蛋白/非组蛋白的去乙酰化作用影响基因转录，还能去乙酰化其他下游靶基因或与之相互作用，来调节能量代谢、细胞老化，最终延长细胞生存和寿命[5]。研究证实，Sirt1降低氧化应激反应、缓解心肌缺血再灌注损伤、减少心肌梗死面积和抑制心肌肥厚的作用[6-10]。在前期研究中，笔者发现在心肌缺氧早期，番茄红素可以通过提高自噬水平达到保护心

4、肌细胞的作用，但具体通路未明确。本研究旨在模拟心肌缺血缺氧中探讨番茄红素是否通过Sirt1调控自噬起到保护心肌的作用。1材料与方法1.1动物与试剂SD乳鼠，清洁级，1～2d龄，汕头大学医学院实验动物中心提供。DMEM-F12、M199和胎牛血清（Hyclone），胰蛋白酶和I型胶原酶（Gibco），5-溴脱氧尿嘧啶核苷BrdU（Sigma），番茄红素（Sigma），沉默信息调节因子1（Sirt1）抗体（Cell7SignalingTechnology），Bclin1抗体（CellSignalingTechnology），尼克酰胺（Sigma），甘油醛-3-磷酸脱氢酶GA

5、DPH（CellSignalingTechnology），免疫印迹发光试剂盒（Millipore），缺氧密闭盒（BillupsRothenberg），RNA酶抑制剂，无核酶水，逆转录酶，脱氧核糖核苷酸混合物，随机引物（Takara）。1.2方法1.2.1原代心肌细胞分离和培养消毒乳鼠，开胸取心脏，用D-Hank溶液去血污，分离心室。置入离心管，剪碎1mm3大小，加入0.125g/L的胰酶37℃消化10min，弃上清，放入Ⅰ型胶原酶0.5g/L，37℃振荡消化2h。用上述胰酶重复消化1～2次，每次约6min。将细胞悬液集中放入含10%胎牛血清培养基，均匀接种到培养皿，放置

6、于5%CO2的培养箱60min以分离成纤维细胞。以1×106/ml密度接种于6孔板，加入0.1g/L链霉素和青霉素防止污染，及0.03g/L的BrdU抑制成纤维细胞生长，最后放入50ml/LCO2培养箱内培养。接种24h后80%的细胞生长成片并有规律搏动时，换无血清M199处理12h后分组干预。1.2.2心肌缺氧处理7预先用无糖、无血清的培养基给细胞换液。放入可封闭的缺氧盒，用含95%氮气和5%二氧化碳的混合气体持续通入10min，密封缺氧盒后继续通入上述气体20min模拟心肌缺氧[11]。然后置于37℃恒温箱培养。对照组换以无糖、无血清的培养基后置于37℃、5%CO2

7、恒温箱培养。干预前将番茄红素溶解于含0.025%丁基羟基甲苯（BHT）的四氢呋喃。1.2.3细胞分组观察缺氧时番茄红素（5μM）对心肌细胞Sirt1的作用，分4组：对照组、缺氧组（Hyp）、缺氧+番茄红素组（5μM）和缺氧+番茄红素+NAM（50μM）组；在缺氧后4h提取蛋白和mRNA，以Westernblot法测Sirt1蛋白水平；RealtimePCR测Sirt1的mRNA表达。观察阻断Sirt1后番茄红素对自噬的影响，分5组：前4组同上，外加NAM组；分别在缺氧后4h提取蛋白，以Westernblot法测定Bclin1、LC3蛋白的