最新实验十三 流式细胞技术检测肿瘤治疗药物诱导的细胞凋亡-药学医学精品资料.ppt

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1、最新实验十三流式细胞技术检测肿瘤治疗药物诱导的细胞凋亡-药学医学精品资料1.实验目的了解细胞凋亡、及流式细胞技术原理等基本知识。学习细胞凋亡的形态学观察和流式细胞术检测的方法。学习流式细胞技术标本的制作方法，了解流式细胞仪的使用。2.实验原理2.1细胞凋亡的基础知识2.2流式细胞技术的一般原理及应用2.3用流式细胞术检测细胞凋亡的原理细胞凋亡与坏死的区别胸腺细胞正常凋亡形态学检测流式细胞法检测DNALadder检测荧光法检测凋亡鉴定方法2.2流式细胞技术的一般原理及应用流式细胞术(flowcytom

2、etry)是以流式细胞仪(flowcytometer，FCM)为工具，在液流系统中对悬液中的单个细胞、细胞器或生物粒子的生物、物理和化学特性进行快速测量并自动分析，并根据这些特性将所需要的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的高技术。它的主要特点是，可以在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数的定量分析及分选，借此判断细胞的体积、DNA含量、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数，并可在无菌状态下，对活细胞进行分类收集，收集的纯度可达99％。流式细胞仪工作原理流式细胞仪（FlowC

3、ytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。散射光信号FALSSensorLaser散射光信号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）

4、细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）流式细胞仪的检测信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号双色直接染色数据分析数据存储:LISTMODE数据显示:直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(Density)三维图（3DPlot）等数据分析直方图分析数据分析点图分析数据分析等高图和密度图分析2.3用流式细胞术检测细胞凋亡的原理利用流式细胞仪测定细

5、胞光散射可对凋亡细胞进行分析。凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变小，SSC增大，凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小，坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、SSC变大，胞膜破裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变小。用流式细胞仪也可以根据DNA含量不同，从细胞群体中鉴别凋亡细胞。凋亡细胞在G1峰前出现亚二倍体峰，即凋亡峰（Ap峰）。通过此峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所占的比率（用凋亡软件定量）。另外，细胞凋亡受基因调控，有赖于某些蛋白质的合成，用流式细胞仪可同时测定凋

6、亡细胞的FSC/SSC及DNA/蛋白质，进行多参数分析以研究不同的凋亡诱导作用机制。3.实验材料、用品实验材料：培养的Hela细胞实验用品：①仪器与用具C02培养箱，超净工作台，倒置显微镜和离心机等。微量加样器(1µl-1ml)，0.5ml和1.5ml的Eppendorf管，20µl、200µl和1ml吸头，10ml培养瓶，载玻片，盖玻片等。②试剂放射线菌素D（诱导细胞凋亡的肿瘤治疗药物，如喜树碱、紫杉醇、中药砒霜等）；荧光探针：用PBS(pH7.4)将PI配成500µg/ml的贮液，在-20℃冻存

7、。FACSCalibur,BDBioscience4.实验步骤Hela细胞的传代培养诱导细胞凋亡：向对数生长期细胞中加入放射线菌素D（可结合科研采用其他诱导细胞凋亡的肿瘤治疗药物）分别为0.25、0.5、1、2、4mg/L,作用6小时。用胰酶消化以上五个样本以及对照的细胞，吹打收集于离心管中，1000r/min下离心8分钟，倒去上清。加约1mlPBS重悬细胞，用注射器迅速注入到4ml4℃的70%的酒精中，固定8小时以上。去上清，用PBS4ml重悬细胞，再1000r/min下离心8分钟，去上清控干液体

8、后加0.3mlPBS，加入RNA酶A至终浓度为50ug/ml，37℃孵育30分钟。将样品插到冰浴中，停止酶的作用。待冷却后加入50ug/ml的PI1.5ml,放于冰上在冰箱中染色至少30分钟。3个小时之内在流式细胞仪上检测样品。5.实验结果正常凋亡化疗前后胃癌活检标本中Caspase-3+细胞化疗前(3.49%)化疗后(94.86%)26KeylabofMedicineSchoolofSuZhouUniversity细胞凋亡——PI分析PI-Fluorescence#