最新培训讲座――分子标记-药学医学精品资料.ppt

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1、最新培训讲座――分子标记-药学医学精品资料主要内容分子标记及其相关概念分子标记的类型与发展几种分子标记介绍1.广义的分子标记(molecularmarker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）一.分子标记相关概念二.分子标记的类型与发展1.分子标记的类型①基于杂交的分子标记，如RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,即限制性长度片段多态性）。②基于PCR的分子标记，它又分为两类：RAPD（Ra

2、ndomamplifiedpolymorphicDNA）DAF（DNAamplificationfingerprinting）SSCP（Singlestrandconfirmationalpolymorphism）小卫星DNA（MinisatelliteDNA）微卫星DNA（MicrosatelliteDNA）,又称SSR（Simplesequencerepeat）ISSR（Intersimplesequencerepeat）AP-PCR（ArbitraryprimerPCR）它主要有SCAR（Sequencechara

3、cterizedamplifiedregion）STS(Sequencetaggedsite)基于PCR技术的DNA扩增方法AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism）AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增CAPS（Cleavedamplifiedpolymorphicsequence）CAPS是先扩增，再酶切扩增片段PCR与酶切相结合的方法③基于DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Singlenucleotidepolymorphism）。三.几种分子标记介绍1.限制性片段

4、长度多态性标记RestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP：限制性片段长度多态性，为第一代多态性记。原理：RFLP是由于染色体上单核甘酸突变或插入及缺失突变导致限制性酶切位点的增加或减少，从而导致DNA酶切片段长度的变化，这种变化的检测通常是应用同位素或酶联免疫标记探针进行检测。RFLP原理示意图GTAGTCGATTGTCGAGAATTCGTCGGTGGTAAGCATCAGCTAACAGCTCTTAAGCAGCCACCATTCEcoRIEcoRI酶切位点单碱基突变导致RFLP多态性R

5、FLP是由DNA一级水平的变异造成的。然而，如果DNA变异的位点不在内切酶位点，变异则很难被检测到，这个缺陷可以用增加内切酶的种类来弥补。这在实际工作中，单一酶切产生的多态性极其有限，主要取决于亲本材料的来源。正常情况下用到6到8种酶来筛选多态性。不同的酶产生的多态性大不相同。技术路线：不同个体DNA的提取酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜Southern杂交数据分析RFLP的特点A不受环境条件和发育阶段的影响B是共显性的C需要对探针进行标记，还要Southern杂交，耗时费力DDNA需要量大，难以用于大规模的育种2.随意扩

6、增多态性DNA标记—RAPDRandomAmplifiedPolymorphismicDNA由单个短的随机序列引物对基因组进行PCR扩增，当两个反向互补引物结合位点间距离满足PCR扩增条件，就可以产生扩增片段。?RAPD扩增产物的多态性是由于引物结合位点或结合位点间发生了重排、缺失或突变导致扩增产物的缺失。原理基因组中存在或长或短的被间隔开的颠倒重复序列WMWMRAPD原理示意图电泳图3、简单重复序列标记—SSR（simplesequenceRepeats）或者称为微卫星DNA（microsatelliteDNA）原理：

7、微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在1—5bp之间，常见的微卫星如(TG)n、(GA)n、(AAT)n或(GACA)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(FlankingRegion)，寻找其中的特异保守区。GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAABCABCSSR原理示意图技术路线：建立DNA文库筛选鉴定微卫星DN

8、A克隆测定这些克隆的侧翼序列设计特异性引物来扩增SSR序列经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。SSR电泳图微卫星标记的优缺点：（1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。（2）微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微卫星位点检测可以显示纯合子和杂合子。（3）微卫星