最新分子生物学技术在医学研究中的应用 基因表达-药学医学精品资料.ppt

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1、最新分子生物学技术在医学研究中的应用基因表达-药学医学精品资料基因表达基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。DNARNAProtein转录翻译影响基因表达的因素：1、遗传因素个体差异，终生不变。2、环境因素激素、药物，细胞因子、机械刺激、病原体感染、电刺激、细胞转化…..2)逆转录：RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，OligodT)5’AAAAAAAA3’TTTTTTTTmRNA

2、cDNA3)PCR特异性引物、模板、Taq聚合酶。通过PCR，将目的片段扩增几十—百万倍。在一定范围内和一定的条件下，PCR的产物量与模板量呈正比关系。循环次数产物量模板量4）几个注意问题：反应平台内参1、PCR效率差异，重复性2、内参选定3、共同扩增4、扩增片段长度5、mRNA丰度，目标片段与内参片段iNOS(诱导型一氧化氮合酶)GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)5)PCR产物量的测定应用图象分析软件进行密度测定。目标带密度-背景密度内参带密度-背景密度=相对量处理后样品相对量处理前样品相对量=变化率100%1

3、60%ABCD2.02.02.01.02.02.01.01.0RT-PCR特点：优点：灵敏度高、特异性高、操作简便。缺点：可靠性差、不能细胞定位。2、Northernblot标记探针与膜固相RNA杂交。根据杂交信号强弱判断表达量，根据杂交信号位置判断分子长度。杂交信号实验操作：1）RNA提取2）RNA电泳（分离不同长度RNA)3）转膜(形成固相RNA)4）探针标记（同位素/非同位素）5）预杂交，杂交6）洗膜7）显影（放射性/酶促）Northernblot特点：因为没有扩增过程，Northernblot的结果可

4、靠性高。可以确定未知基因的转录产物（mRNA）长度。优点：缺点：1、操作烦琐2、同位素3、灵敏度低4、对RNA质量要求高5、不能定位细胞3、Westernblot标记抗体与膜固相蛋白作用。根据信号强弱判断蛋白表达强度。根据信号位置判断蛋白分子量。标准分子量蛋白特异性反应带1）蛋白提取2）蛋白电泳（分离不同分子量蛋白）3）转移4）封闭5）一抗作用6）标记二抗（HRP/AP标记）作用7）显色实验操作：Westernblot特点：优点：直接检测蛋白质的表达量。缺点：灵敏度低一抗制备难度大，购买价格高容易出现交叉反应

5、不能细胞定位4、免疫组化标记抗体与组织细胞作用。根据信号强弱判断表达强度，根据信号位置判断表达细胞。eNOS表达（对照）（实验）实验操作1）组织切片（石蜡/冰冻）2）封闭，内源性过氧化物酶失活3）一抗作用4）二抗（HRP标记）作用5）显色6）复染，封片免疫组化特点：优点：细胞定位缺点：定量不准确，人为因素干扰大（图象分析系统）5、基因芯片特定载体上密集的大量探针与荧光标记的样品反杂交。根据杂交信号强弱判断基因表达强度。基因芯片特点：优点：一次杂交可以得到大量表达信息。通用性好。缺点：成本高，需要专门设备。人类

6、基因组计划揭示了人类有3—4万个基因，转录本多达10万个。基因不同时空表达是细胞结构和功能的基础；是组织、器官和系统发育和分化的基础；也是大多数细胞病变的基础。了解不同状态下的基因表达调节机制是后基因组时代的主要任务，是探索生命本质的重要环节。结束语谢谢曲轴箱窜气量与进气管真空度的检测(1)曲轴箱窜气是每个发动机必然的情况，不管什么品牌什么排量的机器都会有曲轴箱窜气。(2)现在的发动机工作都是靠吸入混和气后压缩然后点燃作工产生动力，从压缩到燃烧中都会产生很高压力，被压缩的气体会从活塞和缸体的缝隙、活塞环开口、

7、活塞环和缸体的缝隙等地方窜出去进入曲轴箱。活塞和缸筒，活塞环和缸筒之间都不是完全密封，活塞和缸筒配合上有一定间隙，缸筒和活塞环之间也不会是完完全全的圆，活塞环为了解决热胀冷缩还有开口缝隙，这些地方都会有被压缩和燃烧的气体泄漏。曲轴箱和缸体、缸盖上的气门室盖是连通的，这些气就会在发动机内流动，就是窜气，习惯上叫曲轴箱窜气，也有叫发动机窜气的。(3)随发动机工作窜气会越来越多必须排放出去否则会影响发动机动力和损坏发动机。曲轴箱窜气中含有不少有害成份，所以从很早以前各国家都规定发动机窜气必须回收再燃烧，这才有了曲轴

8、箱窜气管把窜气从进气道吸入燃烧室再燃烧后从排气管排出。(4)曲轴箱窜气和缸垫没关系，是活塞工作泄漏的气体。说是机油蒸汽也不准确，曲轴箱窜气要经过油底壳，因里边有大量高温机油和机油蒸汽因此会含有不少机油成份，但窜气并不是机油蒸汽。说是汽油蒸汽也比较片面，的确在压缩时会有一部分汽油蒸汽窜出去但也不是全部。曲轴箱窜气中主要包含四种成份：汽油蒸汽、机油蒸汽、燃烧后的废气、各种气体混合后产生化学反应的其它成份