最新[生物学]基因工程-克隆基因的表达-药学医学精品资料.ppt

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1、最新[生物学]基因工程-克隆基因的表达-药学医学精品资料第七章克隆基因的表达9/7/20212遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。一、基因表达：9/7/20213第一节外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物基因表达的特点二、原核生物基因表达的调控三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、几种类型的原核表达载体五、影响外源基因表达效率的因素9/7/20217六、提高表达水平常用的方法七、细菌表达载体举例八、外源蛋白质表达后的正确修饰九、原核细胞表达的缺陷9/7/20218用原核生物作宿主。AdividingE.col

2、i第一节外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子9/7/20219识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点2.以操纵子为单位1.只有一种RNA多聚酶9/7/202110有意义链5’反意义链3’转录mRNA5’3’翻译蛋白质NC5’3’3.转录和翻译偶联、连续进行。9/7/2021119/7/2021124.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shin

3、e-Dalgarno（S-D）序列。6.mRNA的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:9/7/202113是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。二、原核生物基因表达的调控1.启动子-35Box和-10Box（1）启动子序列9/7/202114consensussequences9/7/2021155’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’②-10box（PribnowBox）TTGACATATAAT转录起始位点1

4、7bp5’核糖体结合位点RNA聚合酶σ亚基的识别位点。①-35box9/7/202116（2）翻译的起始位点1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。SDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译9/7/202117全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。2.RNA多聚酶大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。（1）结构9/7/2021183.转录终止子内终止子i

5、ntrinsicterminator：E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子9/7/202119由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互补。①茎环结构②多聚A/U9/7/2021205-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTT

6、AACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)转录↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠↓mRNA折叠UCCUGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAACCCACUUUU—3DNARNA聚合酶脱落9/7/2021219/7/202122大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。4.翻译终止密码5.翻译增强子Translationenhancer能够显著增强

7、外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。9/7/202123①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。③应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件6.基因工程常用的原核启动子9/7/202124来自大肠杆菌的乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。PlacO目的基因（2）乳糖启动子lac9/7/20212

8、5阻遏物与操纵基因结合9/7/202126阻遏物与DNA的结合9/7/202127（3）色氨酸启动子trpt