最新人的端粒酶逆转录酶基因沉默对HeLa细胞增殖、凋亡的影响教学讲义PPT课件.ppt

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1、人的端粒酶逆转录酶基因沉默对HeLa细胞增殖、凋亡的影响国内外研究现状正常细胞经过有限次数的分裂即进入衰老阶段，停止增殖而最终衰亡.但肿瘤细胞似乎成功地摆脱了这种衰老的束缚，表现出无限制加速增殖的永生化能力。这使人们意识到衰老与肿瘤这两大生命科学中的难题之间可能存在着某种联系和转换的必然环节.近年来端粒酶的发现和“端粒假说”的提出，使有关衰老和肿瘤的研究有了长足的进展。包括Science和Cell等在内的国际著名期刊，正以逐年增加刊登论著、述评、视点文章的形式，对端粒-端粒酶这一研究方向作出了肯定，认为有可能对衰老、肿瘤等重大生物学问题的解决产生深远的影响。研究方向探讨靶向人端粒酶

2、逆转录酶（hTERT）的基因沉默对癌细胞生物学行为的影响采用RT-PCR、Westernblot检测筛选出于扰效果好的孤对siRNA，转染HeLa细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，荧光标记后与癌症基因芯片杂交，以两对干扰序列的实验结果相一致的标准来确定差异表达基因。本研究成功筛选出干扰效果良好的两条序列。芯片经扫描后分析杂交结果，EGFR、VEGF、bcl-2三个基因表达下调，TRAIL基因表达上调。认为端粒酶逆转录酶除了具有延长端粒功能外，还参与调控若干与细胞增殖、凋亡相关的基因表达。实验原理hTERT的表达水平与端粒酶活性呈正相关，本实验利用RNA干扰技术对hTERT进行短

3、效抑制，导致若干与肿瘤细胞增殖、凋亡密切相关的基因的表达变化，来探寻hTERT对其的影响。构建针对hTERT基因的siRNA真核表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT,制备靶向hTERT的重组逆转录病毒;用重组逆转录病毒感染hela细胞,以TRAP法检测端粒酶活性变化;流式细胞仅检测细胞凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞生长抑制情况.可行性分析本实验采用的方法均为较常见的实验技术，操作也较为简便，只是时间消耗过长，对实验室温度等条件要求较高，实验时注意对酶活性的保护，应该可以得到预期的结果。实验方法1.hTERT的设计与合成2.细胞转染(图示）3.有效序列的筛选（1）实验分组（

4、2）RT-PCR检测4.Westernblot检测裂解细胞提取蛋白。用酚试剂法进行定量后，将含有等量蛋白的细胞裂解液用样品缓冲液溶解，置于SDS—PAGE(分离胶8％、浓缩胶5％)电泳分离，用半干转方法转移至硝酸纤维素膜，室温下封闭，过夜；加入兔抗hTERT抗体，孵育2h，0．2mol／LNaOH洗膜去除膜上抗体，加碱性磷酸酶标记的二抗，孵育2h，用碱磷酶显色液显色后成像。5.芯片杂交检测实验分为转染组和空白对照组，选取干扰效果好的两条序列作为转染组，分别与空白对照组进行基因差异表达分析预期实验结果靶向hTERT的siRNA转染后可以显著降低HeLa细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导

5、细胞凋亡的发生。本研究利用RNA干扰技术对l·TERT进行短效抑制，导致若干与肿瘤细胞增殖、凋亡密切相关基因的表达变化，说明端粒酶的功能不仅仅是延长端粒，这些基因的表达改变很可能是抑制hTERT治疗肿瘤的非端粒依赖的机制之一。创新性端粒酶相对于其他研究方向更加新颖，2009年，Elizabeth Blackburn因在端粒研究方面的杰出贡献而被授予诺贝尔生理学奖。经费预算由于该实验大部分所需器材和试剂在市场都容易采购,所以费用不会过高,初步估计在两千元左右参考文献1.周雪峰王建军 王家顺人端粒酶逆转录酶基因沉默对肺腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡的影响。[实用医学杂志]2009年第一期2.

6、FleisigHB.WongJMTelomeraseasaclinicaltarget:Currentstrategiesandpotentialapplications[外文期刊]2007(01)RobertHVProspectsandchallengesofbuildingacancervaccinetargetingtelomerase[外文期刊]2008(01)一些基因工程的成果课题组成员：张良骏赵刚谢谢观看祝大家学习进步天天快乐第三单元藏气法时南方医科大学中医药学院冯文林素问·五脏别论(节选)题解别：另外。本篇论藏象学说,是在《素问·六节藏象论》等专论各藏功能的篇

7、章之外,概论脏腑的分类及其总的功能特点,故名。1.脏腑的分类及其功能特点。2.气口独为五脏主。（见于第八单元）3.治病必察其(上)下。（见于第八单元）内容提要目的要求1.了解脏腑的分类、“奇恒之府”的内涵和特点。2.掌握脏和腑的不同功能和生理特点。3.理解“魄门亦为五脏使”的理论及其临床意义。(一)五脏六腑与奇恒之腑的功能特点及其区别　[原文]304黄帝问曰：余闻方士，或以脑髓为藏，或以肠胃为藏，或以为府。敢问更相反，皆自谓是。不知其道，愿闻其说。岐伯对曰：脑、