最新临床基因扩增检验标本的处理保存和核酸提取方法及质量控制3幻灯片.ppt

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1、临床基因扩增检验标本的处理保存和核酸提取方法及质量控制3核酸扩增检测标本采集、运输、存储的重要性临床检验的质量保证关键性环节解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一核酸提取的重要性核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否临床PCR检验操作中最易出问题的环节标本运送样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的

2、运送条件作出相应的规定。检测标本类别全血标本血浆血清骨髓活检组织腹水胸水石蜡切片分泌物新鲜组织毛囊有目的地选择标本类别标本采集器皿标本采集器标本类型决定标本采集器标本采集外周血（HBV/EBV-DNA、HCV-RNA、HLA分型等）抗凝剂使用：首选EDTA或枸橼酸钠，不可使用肝素（强烈抑制PCR反应），不可溶血RNA检测：及时分离血浆，置于无RNase的离心管中送检EBV-DNA检测（小心使用）：小心分离LC，避免混入RBC标本采集其他体液（TB/EBV-DNA等病原）痰：深部痰液，不是唾液胸腹水：无菌抽取，加抗凝剂尿液：尿道口消毒，中段尿鼻咽部

3、：咽后壁分泌物EBV-DNA分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）采样时要采到上皮细胞充分洗涤拭子切片组织标本采集肿瘤组织>40%：直接提取核酸肿瘤组织<40%：必须采用其它方式标本保存&运输（人）标本采集后不得存放于护士站过夜血液标本/体液等：检测DNA，采集后1h内送检，检测RNA，立即送检（30分钟内）活检组织：检测DNA，2h内送检，检测RNA，立即送检（30分钟内）石蜡切片：24h内送检标本保存&运输（病原体）采血后不得长期存放于护士站过夜病原DNA检测：不超过6h，2h内分离血浆/血清短期保存：4℃长期保存：-20℃病原RNA检测

4、：采血后尽快分离血浆&提取RNA短期保存：-20℃，避免反复冻融长期保存：-70℃，避免反复冻融标本长期保存和建库液氮罐超低温冰箱/柜低温冰箱/柜常温冰箱适当温度保存标识清楚、记载详细保存时间信息化管理分析中质量控制—核酸提取DepartmentofHealthandHumanServices,CentersforMedicareandMedicaidServices.Clinicallaboratoryimprovementamendmentsof1988;finalrule.57FederalRegister7170(codifiedat42

5、CFR493.1265);57FederalRegister7176(codifiedat42CFR493.1445(e)(5).核酸提取DNA以正常人同类标本做对照不同标本类型采用不同提取方法4℃保存，长时间-20℃保存RNA以正常人同类标本做对照不同标本类型采用不同提取方法严格按照操作手册，避免降解-20℃保存，长时间-70℃保存制定标准化的核酸提取文件实验操作手工操作为主，固定人员，熟练操作，保持手法的一致性不同厂家提取试剂盒不可混用按质量管理手册进行样品核酸提取的发展方向酚氯仿/乙醇沉淀Chelex煮沸玻璃奶吸附硅胶膜/离心柱磁珠法√√样

6、品核酸提取的发展方向高得率高纯度低拷贝样品的检出，PCR试剂的高灵敏度多重PCR；无杂质，PCR不会被抑制稳定均一可靠的检验结果自动化高效提取，高通量，一体化未来核酸提取技术的必备要素一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。核酸的分离纯化

7、核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。经典方法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。DNA提取的经典方法即所谓的”酚-氯仿提取法”RNA提取的独特性临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。RNA提取所用器皿的处理经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA

8、.实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制