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1、临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法卫生部临床检验中心李金明临床标本的正确采集、运送、保存 的重要性临床检验的质量保证关键性环节解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一核酸提取的重要性核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否临床PCR检验操作中最易出问题的环节标本采集标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集部位的准备标本的类型和采集量采样质量的评价采样及运输容器标本采集中的防污染标本运送样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的
2、EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。临床标本的处理和保存血清（浆）全血外周血单个核细胞痰棉拭子脓液体液乳汁组织血清（浆）DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下。全血以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂
3、的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA。外周血单个核细胞外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下.痰痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本。痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1mol/LNaOH或变性剂液化。如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能
4、室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下。痰标本处理的基本模式通用模式简单模式痰标本处理通用模式试剂：（1）通用标本处理（Universalsampleprocessing,USP）溶液：由4-6mol/L盐酸胍（GuHCl），50mmol/LTris-HCl,pH7.5,25mmol/LEDTA,0.5%Sarkosyl和0.1~0.2mol/Lβ-巯基乙醇。（2）0.05%Tween80。（3）10%Chelex-100(含0.03%TritonX-100和0.3%Tween20)
5、痰标本处理简单模式试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1mol/LNaOH、50μg蛋白酶K和0.05%TritonX-100痰标本处理中要注意的问题痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法提取。采用这种方法提取，有可能会在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶，在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑制其后的扩增。在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制物产生的效果。棉拭子在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块
6、状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下.脓液脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2～3次后,即可用于DNA提取。对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。沉淀标本的保存条件同样为-70℃。体液临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀
7、样本的保存同上。乳汁乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。乳汁中布鲁菌DNA的提取试剂准备①NET缓冲液:50mmol/LNaCl,125mmol/LEDTA,50mmol/LTris-HCl[pH7.6];②24%十二烷基硫酸钠（SDS）;③蛋白酶K;④RNase。乳汁中分枝杆菌DNA的提取试剂准备①裂解液：50mmol/LTris-HCl，10mm
