临床基因扩增检验标本的采集、处理、保存和核酸提取方法

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1、临床基因扩增检验标本的采集、处理、保存和核酸提取方法河北医科大学第二医院微生物室时东彦•一、标本的采集•二、标本的处理和保存•三、核酸提取方法一、标本的采集和运送•常用于基因扩增检测的临床标本包括•EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清、痰、脑脊液、尿及分泌物等。•采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。•当对痰、脑脊液、尿、分泌物等标本采样时，采样者必须戴一次性手套，使用的容器必须是密闭，清洁，干燥，防止

2、来自采样者皮屑或分泌物或空气中细菌的污染。玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，250℃℃烘烤烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。标本的稳定化处理•用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。•由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐（Guanidinethiocyanate,GITC）可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1∶4的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中

3、，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。标本的运送•原则：标本采集后必须尽快送至实验室。•需要转送的标本：用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。•经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本，通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。四.标本的贮存•临床用于DNA（如HBVV--DNADNA）扩增检测的血标本，短期保存（11--33天）在4̊C，保存（11--22周）在-20̊C，较长期在

4、--7070̊C。•临床用于RNA（如HCVRNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，使用EDTA抗凝（严禁使用甘素）全血标本，6小时内分离血浆，以避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。短期保存（11--22周）在-20̊C，较长期在-70̊C。•用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/LTrisis--11mmol/LEDTA缓冲液（pH7.57.5--8.08.0）中4℃保存。•用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。•用乙醇沉淀的核酸样本贮存在--2020℃℃即可即可。•用GITC处理的RNA标本在

5、室温可保存7天。标本的影响因素•一.内源性物质(影响因子）•1.类风湿因子•2.补体•3.嗜异性抗体•4.嗜靶抗原的自身抗体•5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体•6.交叉反应物质•7.标本中其它成分的影响•二.外源性物质•1.标本溶血•2.标本受细菌污染•3.标本保存不当•4.标本凝集不全•5.标本管中添加物质的影响二、标本的前处理•标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤。•通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增

6、反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。痰•常作为结核杆菌DNA测定标本。含有大量粘蛋白和杂质，核酸提取时，用NaOH或变性剂液化痰液，可保存于--7070̊C。•用于非结核杆菌如肺炎支原体PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，使大块粘状物下沉，取上清离心后，再次获得的沉淀物用于核酸提取。痰标本处理简单模式50ul痰液离心6,000g,10min加入裂解液（含蛋白酶K、NaOH、TritonXX--100100）50ul,60度温育30min90度温育30min加入TrisTris--HClHCl中和上述反应混合物取一定量如50ul

7、用于PCR扩增检测棉拭子•在使用PCR方法检测性病病原体时，临床标本一般为棉拭子。可将棉拭子置于适量生理盐水中，充分震荡洗涤后，室温静置55--1100mmin，待大块物沉淀后，取上清立刻离心，其后的沉淀用于DNA提取。•如不立即提取DNA，可将标本保存于-70̊C。脓液•如分离分枝杆菌DNA，粘稠的脓液可采用痰标本处理模式，先液化，再提取DNA；水样脓液则直接离心获得沉淀，用生理盐水洗22--33次后，用于提取DNA。•若是非分枝杆菌的脓液，如过于粘稠，可加入适量生理盐水，充分震荡后静置，取上清立刻离心，其后的沉淀用于DNA提取；如为水样，则直接离心取沉淀。•