微生物油脂工艺研究论文.doc

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1、微生物油脂工艺研究论文１材料与方法１．１材料微生物油脂（含４３％ＡＲＡ），嘉必优生物工程（武汉）有限公司赠送；固定化酶（ＬｉｐｏｚｙｍｅＲＭＩＭ）购于北京诺维信公司；１，３－ＡＲＡ－ＤＡＧ、１，２－ＡＲＡ－ＤＡＧ购于瑞典Ｌａｒｏｄａｎ公司；正己烷、乙酸乙酯、冰乙酸、甲醇均为色谱纯，购于德国ＣＮＷ公司；氢氧化钠、尿素、无水硫酸镁、盐酸、乙醇、石油醚、甘油、无水乙醚、４Ａ型分子筛均为分析纯，购于国药化学试剂集团。１．２试验仪器分析天平（ＡＵＹ１２０，ＳＨＩＭＡＤＺＵ，Ｊａｐａｎ）；旋转蒸发仪（ＲＥ－５２Ａ，上海亚荣生化仪器）；集热式恒温磁力搅拌水浴锅（ＤＦ－１０１Ｓ，

2、巩义市予华仪器有限责任公司）；气相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ７８９０Ａ，美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；高效液相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００，美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；质谱仪（ＡＢ４０００Ｑ－Ｔｒａｐ，美国ＡＢ公司）；微型旋涡混合仪（ＷＨ－３，上海沪西分析仪器有限公司）。１．３试验方法１．３．１尿素包埋法纯化微生物油脂于５００ｍＬ三口瓶中加入４０ｇ微生物油脂、２００ｍＬ无水乙醇、３０％氢氧化钠（以微生物油脂质量计），充氮气保护下，在恒温水浴加热搅拌器上８０℃水浴回流２ｈ，加入１００ｍＬ的蒸馏水，搅拌均匀并冷却至室温，加盐酸酸化至ｐＨ＝１～２左右［１８］。用无水乙醚∶石

3、油醚＝１∶１（Ｖ／Ｖ）混合溶液萃取２～３次，将萃取液水洗至中性，并旋转蒸发除去有机相，得到游离形态的脂肪酸混合物。将其加入到尿素／乙醇溶液中，氮气保护下回流２ｈ后，迅速转移到２５０ｍＬ的锥形瓶中，密封后于－２０℃6学海无涯冰箱中结晶过夜。所得到的尿素包合物经抽滤，旋转蒸发和萃取后，经无水硫酸镁脱水得到纯化后的脂肪酸。称重并计算回收率。并取少量原样品和尿素包埋后的样品进行甲酯化衍生化处理，经ＧＣ检测尿素包埋前后ＡＲＡ的含量变化。１．３．２酶法合成富含ＡＲＡ的１，３－ＤＡＧ按照一定的摩尔比准确称取ＡＲＡ和甘油于２０ｍＬ两口圆底烧瓶中，氮气保护条件下，将其置于一定温度的

4、水浴锅中，待搅拌均匀后，加入一定量的固定化酶ＬｉｐｏｚｙｍｅＲＭＩＭ和２０％（占底物总质量）已活化的４Ａ型分子筛，在２００ｒ／ｍｉｎ的转速下搅拌反应，按一定的时间间隔取样，采用ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＲＭ分析酯化后产物及各组分的相对百分含量。１．３．３脂肪酸的ＧＣ检测脂肪酸的甲酯化衍生化处理采用本实验室建立的方法［１９］。ＧＣ检测条件为色谱柱：ＨＰ－ＦＦＡＰ毛细管柱（Ａｇｉｌｅｎｔ，３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．５μｍ）；检测器：氢离子火焰化检测器（ＦｌａｍｅＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｏｒ，ＦＩＤ）；以氮气为载气，进样口压力为２５ｐｓｉ，进样量为１μＬ，分流比为１∶

5、３０；升温程序：初始温度２１０℃保持７ｍｉｎ，以２０℃／ｍｉｎ升温至２３０℃并保持５ｍｉｎ，总分析时间为１２ｍｉｎ；进样口和检测器温度分别为２６０℃和２８０℃。采用面积归一法计算脂肪酸的相对百分含量。１．３．４产物中１，３－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＲＭ检测产物中１，３－ＡＲＡ－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ检测条件为色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ－ＳＩＬ（５μｍ，２．０ｍｍ×２５０ｍｍ）；流动相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝８０∶２０∶１，（Ｖ／Ｖ／Ｖ）；流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：４０℃；进样量：１０μＬ；总时间：２０ｍｉｎ。检测器ＭＳ的条件为ＡＰＣＩ模式：正离子；ＣＵＲ：１３７．

6、９ｋＰａ；ＣＡＤ：ｍｅｄｉｕｍ；ＮＣ：２７．３８ｋＰａ；温度（ＴＥＭ）：４５０℃；扫描模式：ＭＲＭ－ＥＰＩ；扫描速度：１０００ｕ／ｓ；离子源气体１（ｉｏｎｓｏｕｒｃｅｇａｓ１，ＧＳ１）∶３４４．７５ｋＰａ；辅助加热（ｉｎｔｅｒｆａｃｅｈｅａｔｅｒ，ｉｈｅ）：开；ＤＰ：８０Ｖ；ＣＥ：３５Ｖ和５５Ｖ；碰撞电压摆幅（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙｓｐｒｅａｄ，ＣＥＳ）：５Ｖ；碰撞室输出电压（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｃｅｌｌｅｘｉｔｐｒｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＸＰ）１７Ｖ；质量范围：５００～１０００ｍ／ｚ。采用面积归一法计算产物中１，３－ＤＡＧ的相对百分含量。１．３．５数据分析本实

7、验采用ＳＡＳ（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ）９．０统计软件进行数据处理，实验重复三次，取其平均值。用Ｏｒｉｇｉｎ作图工具，对结果进行分析。6学海无涯２结果与分析２．１尿素包埋法纯化微生物油脂中的ＡＲＡ尿素包埋法作为一种普遍的富集ＬＣ－ＰＵＦＡｓ的方法，一直受到人们的青睐［２１］。本实验中，当尿素∶混合脂肪酸∶甲醇比为２ｇ∶１ｇ∶２０ｍＬ，结晶温度为－２０℃时，经ＧＣ检测分析后，ＡＲＡ的相对百分含量由原来的４３％（如图１中Ａ）提高到８３％，且回收率为５４．３５％。力为２５ｐｓｉ，进样量为１μＬ，分流比为１∶３０；升温程序：初始温度２１０℃保持７

8、ｍｉｎ，以