产油脂微生物

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1、产油脂细菌的分离及鉴定资助：江苏省科技计划项目（项目编号BE2009651）。2任世英：rsy1314@163.com女，副教授；研究方向：微生物学。任世英2*李相前*刘飞*（*淮阴工学院生命科学与化学工程学院淮安江苏223003）提要采用平板分离法，从黄海海域分离到一株聚磷菌，编号为YSR-3，对其进行了部分生理生化特性以及分子特性的研究。结果表明，YSR-3菌体呈杆状，大小为3.5μm×1μm，革兰氏染色阴性，好氧生长；显微镜下观察能运动。最适培养条件为：氯化钠浓度3%，生长温度24℃，起始pH值6.5。该菌能在细

2、胞内累积多磷酸盐形成异染粒。16SrDNA鉴定结果表明，YSR-3属于γ-变形菌纲、盐单胞菌属(Halomonas)。与盐单胞菌属中的其他已知种比较，YSR-3具有其特性：对氯霉素和卡那霉素敏感、淀粉水解呈阳性、反硝化和几丁质降解呈阴性、能将葡萄糖作为唯一碳源和能源。关键词聚磷菌，多磷酸盐，异染粒，盐单胞菌0引言油脂是构成和维持生命的基本物质之一，也是重要的工业原料，具有重要的应用价值。传统油脂资源主要来源于动植物，能源油则主要来源于矿物资源。随着生物技术的快速发展和人们对微生物油脂的深入研究，用微生物发酵生产油脂为油

3、脂资源的开发提供了一条新途径[1]。微生物生产油脂不仅具有油脂含量高、原料来源丰富、生产成本低、生产周期短等优点，而且可用细胞融合、细胞诱变等方法，使微生物产生高营养油脂或某些特定脂肪酸组成的特种油脂，如EPA、DHA、类可可脂等。产油脂的微生物主要有：细菌、微藻、酵母、霉菌等。微生物油脂的研究主要集中在利用微生物生产特种功能油脂和开发生物柴油。高产油脂或富含稀有脂肪酸产油微生物的研究已有报道。目前，美国、德国、日本等国已有商品化的微生物油脂面市。在欧洲、中东、南亚和澳洲等地已允许将某些微生物油脂添加到婴儿食品中[2]

4、。因此开展微生物油脂的研究对解决人类面临的人口增长、资源短缺、环境恶化、人类健康等现实问题具有重要的意义。1材料与方法1.1菌株与试剂所用E.coliTOP10为实验室保存，用Luria-Bertani培养基进行培养。合成引物、PCR用试剂、TaqDNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、质粒抽提试剂盒、MspI酶切试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成，其他药品和试剂为国产分析纯。1.2培养基1.2.1分离培养基（g/L）葡萄糖5，尿素1，硫酸铵1，磷酸二氢钾2.5

5、，磷酸氢二钠0.5，七水合硫酸镁1，七水合硫酸铁0.1，酵母膏0.5，琼脂20，pH4.5。1.2.2摇瓶发酵培养基（g/L）葡萄糖4，硫酸铵2，酵母膏1.9，磷酸氢二钠2，磷酸二氢钾7，七水合硫酸镁1.5，pH6.0。1.2.3肉汁胨培养基（g/L）蛋白胨10，NaCl5，牛肉膏3，pH7.3。1.2.4LB培养基胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7。以上培养基均于0.1Mpa，121℃蒸气灭菌20min。1.3样品采集与处理用取样铲将有机质丰富的土壤表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样2g，

6、装入含有100mL无菌水的250mL容量的三角瓶，加入玻璃珠，28℃，150r/min摇床振荡30min备用。1.4菌株的分离纯化取振荡后液体0.5mL，进行梯度稀释，取0.1mL的10-6梯度菌液，涂布于分离培养基平板，28℃恒温静置培养2-4天，将长出的单菌落在相同培养条件下，划线分离3次以上，进行菌株纯化，分别编号。1.5产油脂菌株的鉴定对纯化到的菌株进行苏丹黑染色[ddd]，显微镜观察是否形成油脂，获得实验菌株。1.6种子液制备挑取单菌落接种于液体发酵培养基，28℃恒温，150r/min振荡培养12h，作为种子

7、液。按装瓶培养基体积的10%进行移种。以下试验无特别说明均按上述条件进行培养。1.7生长曲线绘制将种子液移种到发酵培养基培养，每隔1h取样，用7300型分光光度计测OD600nm。1.8胞内油脂的提取将发酵培养基培养的菌液在3000r/min下离心30min，收集得湿菌体。胞内油脂提取方法[16]如下：1.8.1盐酸水解法精确称取2.5g湿菌体，添加40mL4mol/L的盐酸，室温下静置20min，沸水浴加热10min，加入适量氯仿-甲醇（2：1，v/v），振荡30min，然后在3000r/min下离心30min，分液

8、，取下层氯仿层，75℃水浴挥发除去氯仿即得油脂。计算油脂产率，以油脂（g）/湿菌体（g）表示油脂产率。1.8.2有机溶剂法精确称取2.5g湿菌体，菌体沉淀按每克菌体3mL的比例加入氯仿：甲醇（1：2，v/v）提取液，充分振荡2min，再加入1mL氯仿，振荡混匀，加1.5mLH2O，振荡混匀后3000r/min离心30min，取氯仿