燕麦乙酰辅酶A羧化酶基因CT区的克隆及CRISPRCas9技术体系建立.docx

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1、燕麦乙酰辅酶A羧化酶基因CT区的克隆及CRISPR/Cas9技术体系建立燕麦属于禾本科燕麦属(AvenaL.),一年生草本植物,是重要的粮食及饲草、饲料作物。化学除草剂的出现及广泛使用为田间除草带来了有效且省工的办法。“拿捕净”又名稀禾啶,是一种选择性除草剂,使用“拿捕净”清除燕麦田间的禾本科杂草时会对燕麦造成伤害,限制了除草剂对燕麦田间禾本科杂草的清除。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是植物代谢过程中催化植物脂肪酸合成的关键酶、限速酶,是“拿捕净”除草剂作用的靶蛋白,“拿捕净”识别ACCase的蛋白结构并与之相结合,从而达到抑制ACCase活性的目的,使脂类代谢受阻,进而杀死禾本科

2、杂草。本研究克隆甜燕1号(sweety1)的ACCase的CT区序列,进行生物信息学分析;构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过基因枪转化法将载体导入甜燕1号(sweety1)成熟胚中,以期获得抗“拿捕净”燕麦新种质。研究得到以下结果:1.利用同源序列克隆的方法,得到燕麦ACCase基因的CT区序列的2188bp,与已经报道的小麦(Triticumaestivum)、日本看麦娘(Alopecurusjaponicus)、大穗看麦娘(Alopecurusmyosuroides)等ACCase序列同源性较高。且小麦序列中第1769个氨基酸位点是异亮氨酸,对“拿捕净”不敏感,通过对比

3、燕麦的ACCase基因在该位点因为同样是是异亮氨酸。2.利用CRISPR/Cas9技术构建了抗“拿捕净”表达载体。3.得到53株经基因枪转化的植株,经阳性鉴定分析,一共获得2株Cas9编辑所产生的突变植株。均为小片段的缺失,这种缺失是随机的不定向缺失,但在这2株有突变的转基因植株中,均没有检测到修复模板的正确整合。4.本试验中利用基因枪法的转化效率为3.8%。本研究首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对燕麦基因组进行编辑,为基因编辑技术在燕麦分子育种中的应用提供了实验依据。