酵母杂交技术原理及应用

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1、目的基因的分离目的基因的功能克隆序列克隆法筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术利用差示分析法分离目的基因克隆DNA插入诱变法分离目的基因根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆目的基因的功能克隆通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他蛋白分离技术分离出一定发育时期的特异蛋白应用蛋白质测序技术测定特异氨基酸序列，推测编码该蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸片段作为探针从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因将分离纯化的特定编码蛋白作为抗原，利用免疫动物制备抗体用特异的蛋白质抗体筛选含有目的基因插入序列的cDNA表达文库，分离出含有目的基因的克隆。在平板上涂布文

2、库和制备硝酸纤维滤膜的拷贝然后将滤膜处理（但不能在80度烘烤），暴露菌落或噬菌斑中的蛋白，在将滤膜放入含有抗体的溶液中，温育一定时间后，洗去未结合的抗体，在加入第二抗体或葡萄球菌蛋白A。第二抗体是用放射性同位素或生物素或酶标记的，通过该标记找到表达产物能与抗体结合的克隆，从而筛选出目的cDNA克隆。返回自然界中有一些蛋白质的核苷酸编码序列，在其进化的过程中保持着高度的保守性，这样就使核酸的种间杂交成为可能。已知组蛋白在因、肌动蛋白基因及β-神经生长因子（β-nervehrowthfactor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA探针，并已成功地用于分

3、离相关的基因。　　在同一蛋白质家族内，也存在着具有共同氨基酸序列的区段，即所谓的保守区。这些保守区往往是由彼此相邻的6-7个氨基酸组成，这样的长度显然适合于推导合成寡核苷酸探针库，用来分离编码相关蛋白质的cDNA。序列克隆法根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因表达序列标签法分离目的基因ESTs基因表达序列分析法返回利用差示分析法分离目的基因克隆mRNA差别显示技术mRNA差别显示技术抑制性减法杂交技术返回酵母双杂交酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表

4、明，转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域(DNAbindingdomain，简称为BD)和转录激活结构域(activationdomain，简称为AD)，BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能（如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可

5、结合到Gal4结合位点并激活转录）如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那么GAL4DNA结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。1）将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein（诱饵蛋白）的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。2）将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母（这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成A

6、DE、HIS、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。）3）当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain的载体；b含DNA-activatingdomain的载体。这二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告

7、株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147)；LexA(Ecoli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报

8、道株指经改造的、含报道基