酵母单杂交技术的原理及应用(1)

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1、450ISSN1009一3079CN14一1260/R酵母单杂交技术的原理及应用马守东,洪源,成军马守东,洪源,成军.中国人民解放军第3()2医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市10093项目负贵人:成军门00039北京币西四环中路100号,中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室e]@genetherapveomen电话:010一66933391传真:010一63801283收稿日期2002一10一29接受日期二20

2、02一11一18马守东洪源成军酵母单杂交技术的原理及应用世界华人消化杂志加30;11(4):405一451htP:/lwwwwjgneteom/1009一3079川j450htmO弓l言酵母单杂交(yeastonehybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋自质相互作用的一种方法,通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析,来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因,或对DNA结合位点进行分析.运用此技术,能筛选到与DNA结合的蛋白质,并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核昔酸序列,而无需复杂的蛋自

3、质分离纯化操作,故在蛋白研究中,具有一定的优势;而且,酵母属真核细胞,通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况.1酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术最早是1993年由iLtela日夕队酵母双杂交技术发展而来,酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋自质间相互作用的研究3[一16,而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测,分析DNA、蛋自之间的相互作用,以研究真核细胞内的基因表达调控.目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与.这些转录因子

4、通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋自相互作用的激活功能域组成,即DNA结合结构域(DNA一bindingdomain,BD)和转录激活结构域(aerivatlondomain,AD).用于酵母单杂交系统的酵母(认L4蛋自即是一种典型的转录因子.研究[12表明(;A以的DNA结合结构域靠近梭基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖昔酶的上游激活位点U(AS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFllD相互作用,提高RNA聚合酶的活性.在这一过程中,DNA结合结构域和转录

5、激活结构域可完全独立地发挥作用.据此,我们可将GA4L的DNA结合结构域置换为其他蛋自,只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用,就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶,从而启动对下游报告基因的转录.正是基于这一世界华人消化杂志2003年4月15日第1卷第4期理论,酵母单杂交系统由2部分组成:(1)将文库蛋自片段与GAIA转录激活域融合表达的CDNA文库质粒;2()含有目的基因和下游报告基因的报告质粒.在实验中,首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株;再将文库质粒转化

6、人报告株;若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来.2酵母单杂交技术的应用酵母单杂交技术是建立在许多真核转录因子在结构和功能上是由独立的DNA结合结构域和DNA激活结构域组成的基础上,这使得研究者可以构建不同的基因融合体,在酵母中表达融合蛋白,以同时结合特异的目的基因和激活转录.理论上,在酵母单杂交技术中,任何目的基因都可捕获能与目标因子特异结合的蛋自][z.目前,酵母单杂交技术的应用可以归纳为以下二类:21鉴别DNA结合位点,并发现潜在的结合蛋白基因目前对

7、于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面.Chewte盯J7l应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP一TFI、EARZ和NURRI等蛋白质是GRIKS基因的内含子结合蛋白,从而进一步验证了多种核孤儿受体可通过与内含子序列结合发挥其调控神经递质受体基因作用的假设.Weietaj8j[199年运用此技术确定了特异性结合于海胆胚胎孵化酶(SpH)E基因调控区域的反式激活因子SPE、t4.Siewekeeral[91运用酵母单杂交技术对转录辅助因子进行了筛选.Hunagte盯l’`J)为分离与人s一

8、珠蛋白基因上游沉默子片段相互作用的蛋自,运用酵母单杂交技术,利用人肝CDNA文库进行筛选,得到能与其结合的蛋白RP”i(rhoosamlorPeti。L3),并通过电泳迁移率变动实验(EMS)A和竞争抑制实验证实其确有结合该沉默子活性,进而说明RPL3通过与人。-珠蛋自基因上游沉默子结合,在胚胎阶段的沉默人。-珠蛋白基因表达中扮演了重要角色.iLa。ella日’{于0220年运用酵母单杂交技术筛选出了能与大鼠谷胧甘肤S-转移酶G(s乃P增强子GPEI核心序列相互作用的