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1、DOI：10.13523/j.cb.200104135生物工程进展62001,Vol.21,No.4酵母单杂交的原理与应用实例陈峰李洁张贵友刘强(清华大学生物科学与技术系植物分子生物学实验室北京100084)摘要许多诱导型基因的表达,都受特定的转录因子和顺式元件调控。要阐明各种信号传递途径与基因表达调控的机理,克隆和鉴定转录因子是关键。近年来酵母单杂交方法被广泛应用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子,本文以拟南芥DREB转录因子的克隆为例,介绍酵母单杂交方法的原理和具体应用。关键词酵母单杂交基因表达顺式作用元件转录因子真核生物中各种转录因子在转录水平的调控
2、是的结果。基因表达调控的主要方式。典型的转录因子都有DNA结合区与转录激活区(或抑制区),在特定的时间、部位或特定条件(如胁迫条件)下,特定的转录因子与靶基因启动子的顺式作用元件特异性结合并相互作用,就可以激活或抑制靶基因的表达。要阐明细胞内各种信号转导与基因表达的机制,以及细胞对外界环境刺激引起的一系列信号传递与应答基因表达调控等机理,鉴定各种调控基因表达的顺式作用元件和转录因子至关重要。酵母单杂交方法(YeastOne-hybridmethod)是根图1酵母单杂交原理示意图据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元转录因子与顺式元件结合,激活最
3、基本启动子Pmin,使报道基因件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转表达。构建3个顺式元件,可增强转录因子的识别和结合效率。[1]录因子的基因(cDNA)。该方法也是在细胞内(inYamaguchi-Shinozaki等从干旱处理的拟南芥中vivo)分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效克隆了9个受干旱胁迫诱导基因,定名为RD(re-方法。如图1所示,将已知的特定顺式作用元件构sponsivetodehydration)基因群。其中最引人注目的建到最基本启动子(minimalpromoter,Pmin)上游,一个是rd29A基因,它不仅受干旱的诱
4、导,也受高盐Pmin启动子下游连接报道基因。进行cDNA融合表及低温的诱导。通过启动子分析,鉴定出与干旱高达文库筛选时,编码目的转录因子的cDNA融合表盐及低温胁迫下rd29A基因表达调控有关的顺式作达载体被转化进入酵母细胞后,其编码产物(转录因用元件,称为DRE顺式作用元件(dehydration-respon-子)与顺式作用元件结合,就可以激活Pmin启动子,[5]siveelement),序列为TACCGACAT。Liu等利用并促使报道基因表达。根据报道基因的表达,筛选DRE顺式作用元件和酵母单杂交方法,克隆了与出与已知顺式元件结合的转录因子。Wa
5、ng和ReedDRE元件特异性结合并在上述胁迫条件下调控报最初利用酵母单杂交方法,从嗅觉上皮神经元中克[6]道基因表达的DREB转录因子。本文以DREB转[2]隆到编码OLF-1转录因子的cDNA。随着酵母单录因子基因(cDNA)的克隆为例,介绍如何应用酵母杂交系统的不断发展和完善,该方法近年来已被广单杂交方法来获得编码特定转录因子的cDNA,并验泛用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子。例如,证它与特定的顺式作用元件的结合。限制哺乳动物神经元钠通道基因表达的一种沉默子[3]1cDNAAD融合表达文库(cDNAADfusionli-蛋白REST,与胡萝卜Dc
6、3基因启动子ABA诱导brary)的构建和胚特异性表达相关的顺式元件相互作用的一族新的bZIP转录因子[4],都是应用酵母单杂交方法获得应用酵母单杂交方法筛选编码特定转录因子的57cDNA,首先要构建cDNAAD融合表达文库。AD是合适酶切位点的连接物(adaptor),构建到融合表达激活区(activationdomain)的简写,一般常用GAL4因载体中GAL4AD下游的多克隆位点(图2A)。然子。目前酵母单杂交中常用于构建cDNA文库的后,进行噬菌体包装(packaging),在XL-1细胞内进AD融合表达载体有pGAD426(Clontech公司
7、)和行自动剪接环化(invivoexcision),最后提取cDNApAD-GAL4phagemidVector(HybridZAPTM,STRATA-质粒用于筛选。GENE公司)。为了有效地克隆某些特定的转录因2酵母报道子(Yeastreporter)的构建子,如在干旱或低温胁迫下调控植物相关耐性基因表达的转录因子,可将植物进行适当的干旱或低温这是用酵母单杂交方法克隆特定转录因子中的处理,再提取mRNA。这样获得的mRNA里,编码目一个重要内容。将已知的特定顺式元件的重复序的转录因子的基因的含量可以提高几倍至几百倍。列,按同一方向串联连接起来,构建到接
8、有报道基因对于某些正常情况下不表达的基因,必须经过一些的最基本启动子(Pmin)
