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1、透明质酸修饰载CTD的PLGA纳米粒的构建及抗肿瘤作用以毒攻毒是中医治疗癌症的一种重要手段。斑蝥素（CTD）是我国传统大毒中药斑蝥的有效成分,已被证明对多种恶性肿瘤有抑制作用。但是CTD水溶性差、安全范围窄（成人致死量为10-80mg）,限制了其临床应用。构建纳米载药系统具有提高药物水溶性、降低药物毒性、提高生物利用度等优势。在纳米载体表面修饰主动靶向分子配体,可以提高靶向性,增强药物疗效,降低对非靶向性部位的毒性。透明质酸（HA）是一种无毒的靶向配体,在肝癌、乳腺癌、胃癌等细胞表面均有过度表达的HA受体。将CTD与纳米载药系统结合,并在表面修饰主动靶向
2、配体HA,对增强CTD的靶向性和降低毒副作用具有重要意义。构建透明质酸（HA）修饰载CTD的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒（HA-PLGA-CTD）载药系统:采用超声乳化溶剂挥发法制备PLGA纳米粒,并利用静电结合原理,将HA吸附在PLGA纳米粒表面。单因素考察水相中十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浓度、PLA（聚乳酸）/PGA（羟基乙酸）配比、PLGA分子量、HA分子量、HA溶液浓度、有机溶剂和投料比对纳米粒的影响,以粒径、电位和包封率为评价指标正交设计优化制备工艺。优化处方为:浓度为1.5%的CTAB溶液,PLA/PGA配比为75/25,P
3、LGA分子量为7000,HA分子量为6700,HA浓度为2%,有机溶剂为丙酮,投料比为20:1。HA-PLGA-CTD纳米粒的表征:（1）激光粒度仪测定纳米粒的粒径、PDI和电位。纳米粒的平均粒径为157.3±7.13nm,PDI为0.194±0.042,平均电位为-12.7±1.94mV。（2）电子透射电镜（TEM）观察纳米粒的形貌,纳米粒呈大小均一的球形或类球形。（3）考察纳米粒的稳定性,纳米粒在贮存30天内、稀释50倍、加入牛血清白蛋白（BSA）、0.9%NaCl和200U/mL肝素钠后,纳米粒的粒径均无明显变化,溶液状态澄清,表明稳定性良好。（4
4、）体外溶血实验考察纳米粒的溶血性,在纳米粒浓度达到2mg/mL时,溶血率小于5%,表明生物相容性良好。（5）体外透析法考察纳米粒的释放特征,纳米粒在1h后,累计释放度达到69.23%。在24h后达到90.47%,释放较为完全。HA-PLGA-CTD纳米粒的体内外抗肿瘤作用研究:（1）建立BALB/c小鼠肝癌H22皮下移植肿瘤模型,将小鼠分为模型组（生理盐水,0.1mL/10g）、阳性组（环磷酰胺,20mg/kg）、CTD原药组（400μg/kg）、PLGA-CTD纳米粒组（非靶向制剂,400μg/kg）和HA-PLGA-CTD纳米粒组（靶向制剂,400μ
5、g/kg）,尾静脉注射方式,隔天给药。计算肿瘤体积、抑瘤率,HE染色法观察肿瘤组织切片。结果显示,阳性组、CTD原药组、PLGA-CTD纳米粒组和HA-PLGA-CTD纳米粒组的抑瘤率分别为49.83%、47.95%、52.69%和64.89%。与CTD原药组和PLGA-CTD组相比,HA-PLGA-CTD组的肿瘤组织中的肿瘤坏死区域明显变大。（2）采用MTT法考察CTD原药、PLGA-CTD纳米粒和HA-PLGA-CTD纳米粒对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549的增殖抑制作用。结果显示,作用24h后,CTD原药对HepG2
6、、MCF-7、A549的IC50分别为4.04±0.17μg/mL、3.54±0.08μg/mL、3.28±0.08μg/mL;PLGA-CTD纳米粒对HepG2、MCF-7、A549的IC50分别为2.71±0.03μg/mL、3.22±0.18μg/mL、2.15±0.43μg/mL;HA-PLGA-CTD纳米粒对HepG2、MCF-7、A549的IC50分别为2.26±0.03μg/mL、2.43±0.13μg/mL、1.83±0.03μg/mL;采用DAPI染色法检测MCF-7细胞
7、的凋亡情况,结果表明,相同浓度的HA-PLGA-CTD纳米粒组更容易引起肿瘤细胞凋亡。结果表明,靶向制剂HA-PLGA-CTD纳米粒可明显增强抗肿瘤作用。HA-PLGA-CTD纳米粒的初步靶向性研究:（1）构建载香豆素-6（C-6）的PLGA纳米粒（PLGA-C-6）和HA-PLGA-C-6纳米粒,PLGA-C-6的粒径为178.87±8.26nm,浓度为8.06±0.03μg/mL。HA-PLGA-C-6的粒径为185.39±3.43nm,浓度为7.37±0.01μg/mL。（2）以C-6为模型药物,荧光显微镜和荧光酶标仪考察察HepG2和MCF-7对
8、药物的摄取情况。作用4h时,HepG2对C-6、PLGA-C-6和HA-PLGA
