透明质酸修饰纳米银抗肿瘤应用初步研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名捌日期：矽f年年乡月7尹关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位

2、论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名兰霾垒噬论文导师签名日期：跏，蛑r月哆摘要目的：制备透明质酸．纳米银复合物，研究其肿瘤细胞靶向性以及其抗肿瘤活性，探究其抗肿瘤细胞的作用机制，为纳米银在肿瘤治疗应用提供实验依据。方法：通过化学反应使透明质酸(HyaluronicAcid，HA)的羧基与五亚乙基六胺的氨基偶联，合成制备得到氨基化HA。并利用氨基化HA的还原性来制备纳米银(HA-AgNP)。由于HA能与肿瘤细胞表面高表达的CD44结合，可作为

3、靶向配体，提高纳米银的肿瘤细胞靶向作用。HA．AgNP的理化表征及细胞学研究包括：采用马尔文粒径仪测定HA．AgNP的粒径和电位；用透射电子显微镜考察HA—AgNP的形态及分散均匀度；使用邻苯二胺衍生法检测银离子含量：使用热重分析法测定HA．AgNP的载药量；使用比浊法考察纳米粒在超纯水、PBS和培养基的稳定性；使用荧光显微镜观察肿瘤细胞对HA—AgNP的摄取作用；用MTT法考察HA．AgNP对肿瘤细胞的杀伤作用；用流式细胞仪定量检测细胞对HA—AgNP的摄取情况；用JC．1标记线粒体，观察HA．AgNP对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响；PI染色法

4、测定HA．AgNP对细胞周期的影响；使用MDC观察肿瘤细胞的自噬囊泡；HO／PI双染法检测HA—AgNP对肿瘤细胞凋亡作用；使用激光共聚焦显微镜观察HA．AgNP与肿瘤细胞CD44的相互作用。在所有的细胞实验中均采用蔗糖还原法制备的AgNP作为对照。结果：通过化学偶联成功制备了氨基化的HA，通过TNBS法测定其氨基含量，得其含量为lmMol／g，其修饰率为40％。在370C的条件下与硝酸银反应生成HA．AgNP复合物，HA具有稳定剂和还原剂的双重作用，HA—AgNP的粒径为300nm左右，zeta电位为17．2mV。热重分析法得HA—A．gNP

5、的载药量为13．1％。且HA．AgNP在超纯水、PBS和培养基中能够稳定存在。细胞实验表明，HA．AgNP对CD44+的SW480细胞和CD44。的MCF一7细胞均具有高效的肿瘤杀伤作用，但SW480细胞优于MCF．7细胞。HA．AgNP能够与肿瘤细胞表面的CD44结合，并通过CD44介导内吞进入细胞，在细胞内引起线粒体膜电位下降，周期阻滞，细胞核固缩，从而抑制细胞增殖，最终导致细胞凋亡和自噬。结论：本研究制备的新型HA．AgNP可有效抑制肿瘤细胞增殖，尤其对并具有CD44+肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，其机制可能是通过引起线粒体膜电位下降，细胞

6、核固缩，周期阻滞，最终细胞凋亡或者自噬引起细胞死亡，提示凋亡途径可能为线粒体途径。关键词：纳米银；透明质酸；抗肿瘤；CD44；凋亡；自噬IIAntitumorstudiesofHyaIuronicAoid-roodifiedsiIverNanopartiCIeSSpeciaIty：BasiGofChirleseTraditionaIandWesternMediCineAuthor：JianmingLiangTutor：Prof．0inXuProf．YongzhuoHuangAbstractObjectIve：Thehyaluronicacid—

7、modifiedsilvernanoparticleswaspreparedforimprovingtumortargetingdeliveryandantitumorefficacy．Themechanismsoftheanti-tumoreffectwereexplored，providinghelpfulinsightintocancertherapyofsilvernanoparticlesforclinicalapplication．Methods：Thecarboxylgroupofhyaluronicacid(HyaluromcA

8、cid，HA)waschemicallyconjugatedwiththeaminogroupofpentaethylenehexamineforpr