实验三 线粒体和液泡系的超活染色与观察.doc

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1、实验三线粒体和液泡系的超活染色与观察实验目的一、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。二、学习一些细胞器的超活染色技术。实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞舶死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、

2、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学，，特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以

3、碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B（JanusgreenB）和中性红（neutralred）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。实验用品一、器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀、载玻片、凹面载玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。二、试剂1．Ringer溶液氯化钠0.85g(变温动物用0.65g)氯化钾0.25g氯化钙0.03g蒸馏水100ml2.10％、1／3000中性红溶液称取0.5g中性红溶

4、于50mlRinger液，稍加热(30~40'C)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1％中性红溶液lml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。3．1％、1/5000詹纳斯绿B溶液称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger溶液中，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1％原液。取1％原液lml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。三、材料1.小白鼠肝细胞。

5、2.人口腔上皮细胞。3.洋葱鳞茎内表皮细胞。4.蟾蜍胸骨剑突软骨细胞。5.小麦或黄豆幼根根尖。实验方法一、线粒体的超活染色与观察线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体面围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。(一)人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察1.取清洁载玻片放在37℃恒

6、温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。2.实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。3.在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。(二)小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察1.用颈椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，

7、取小白鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。。2.在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加]／5000詹纳绿B溶液，再将肝组织块移人染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(一般需染20~30min)。3.吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。4.在

8、低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1～2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。(三)洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察1.用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15min。2.用吸管吸去染液，加一滴Ringer液．注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察