HPLC柱切换技术及其在药物分析中的应用.docx

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1、综灸兰·柱切换技术及其在药物分析中的应用华西医科大学药学院(成都6004)郭平李章万摘要对柱切换技米及其在大体积进样,血浆直接进样,全血进样,在线浓缩、净化、衍生化等方面的应用情况进行了综述。对柱切换系统、色语柱和流动相的要求,以及常见问题的处理方法进行了介绍。关键词柱切换;直接进样;在线浓缩净化;在线衍生化柱切换(eolumnswitehing)这一术语,早在2970年Snyde:就已使用,在现代液相色谱的各种不同的操作方式以及文献中也往往使用其它一些同义术语,如顺序色谱(sequential。hromatogr

2、aphy),多柱色谱(multi-pleeolumnehromatography),偶合柱色谱(eoupledCol-umnChromatography),分流色谱(splitehromatography)[,〕。此外,多维色谱(multipledimen-sionalehromatography),自动高效液相色谱(automatedHPLC),在线(on一hne)前处理等过程中隐含使用了柱切换技术。HPLC柱切换技术实际上是指那些能够由阀来改变流动相走向与流动相系统,从而使洗脱液在一特定时间内从一级柱(prim

3、arycolumn)进入到二级柱(seeondarycolumn)的技术。例如若需要用两个或两个以上柱子联接构成色谱网络n(tewor)k系统,使不同的柱子达不同的分离目标,就需要将柱子间用切换阀来联接,这就是柱切换技术。实现HPLC柱切换技术,往往只需要在传统的HPLC系统中增添一个(或多个)切换阀即可。而切换阀(六通阀或十通阀川)通常是由色谱系统中的程序控制其切换时间。手动切换阀难以准确控制切换时间,实验结果的重现性不好,体现不出柱切换技术的优越性,故一般不采用.根据不同的分离目的,切换方式(即切换阀与色谱柱的

4、联接方式)有多种多样lj[,图1所示是一典型的切换示意图,主要用于在线净化样品。图la中是将样品进入到一级柱后,用二级流动相以同方向将一级柱上的组分冲入二级柱(“正冲”方式);图lb是二级流动相以反方向将组分冲入二级柱(“反冲”方式)。在实际使用时,可根据不同的实验目的及设备条件自行设计连接方式。使用柱切换的主要目的可概括为:()l增加色谱的中国药学杂志1995年4月第03卷第4期图1单阀双泵切换图a一“正冲”模式;b一“反冲”模式。切换后,阀8()虚线部分联通,实线部分断开l一一级流动相;2,7一泵沼一进样阀;

5、4一一级柱;5一废液;6一二级流动相;8一切换阀;9一二级柱;01一检测器分辨率及选择性;()2富集微量组分;(3)在一个色谱网络中达到多个分离目标;(4)在线衍生化,提高检测灵敏度及衍生化重现性;(5)在线净化样品,使前处理自动化。柱切换技术近01多年来发展迅速,该技术已被广泛应用于分析的各领域,如环境保护、农药残留监测、食品检验、生化分析、体内药物分析以及制剂分析。其中在体内药物分析中的应用最为广泛,所发表的有关文章最多。现就几个方面的典型应用作一简要介绍。1样品沉淀蛋白后进样生物样品由于被测组分浓度通常较低,

6、并往往含有蛋白质,经有机溶剂提取后,一般需挥干浓缩、再溶解等若干步骤的前处理,其过程相当繁杂、费时。采用HPLC柱切换技术可省去这些步骤,使前处理大大简化。方法之一是在样品中加入适当的蛋白沉淀剂(如三氯乙酸、甲醇、乙睛等)去蛋白后,将上清液大容量直接.195.注入一级柱〔卜〕。一级柱又1称预处理柱一般是一m的短柱,填料一般是较小粒径的颗粒(如5,01拌m),可使被测组分尽量浓缩在柱上而谱带不展宽。冲洗一级柱的流动相(预处理流动相),可选择水或含适当浓度有机溶剂的水溶液,以便使被测组分在一级柱上保留,而杂质被冲洗掉,

7、从而起到净化浓缩作用。此后切换阀自动切换,以另一种流动相(分析流动相)将一级柱上净化后的组分全部或部分冲洗进二级柱(分析柱)进行再分离。由于进样前样品中蛋白质被基本除去,通常一级柱的寿命一般很长,这是本法的优点。若采用甲醇或乙睛等与水混溶的有机溶剂作沉淀蛋白剂,上清液须加入适当体积的水稀释,以降低有机溶剂的浓度,防止被测组分在净化过程中从一级柱上被洗脱由于切换过程中有较大体积的一级流动相进入二级柱,二级柱的平衡可能被破坏,往往会产生系统峰(不进样切换后所产生的峰),有可能干扰测定。若遇这种情况,可调节一级流动相的p

8、H川,使其尽量与二级流动相接近,也可改变一级流动相的组成(如加入与二级流动相相同的盐类等),往往可能解决这种干扰。柱切换的另一问题是峰展宽。一级柱存在死体积以及从一级柱上洗脱被测组分往往需要一定体积的二级流动相,这相当于增加了进入二级柱的进样体积;另外还因为一级柱填料种类、规格、填充质量的不同,被测组分在一级柱上有时可能会谱带展宽,进而影响分离和降低灵敏度。