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时间:2020-12-20
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1、ELISPOT技术原理 在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答(B细胞免疫),细胞介导的免疫应答(cellmediatedimmuneresponse,CMI)也是人们所关注的,而T细胞在CMI中起关键作用。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法(ELISA)检测体液中游离的细胞因子(CK)或抗体,但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同,使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合,而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代,国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理,建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术(EL
2、ISPOT)。作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT),是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC)或分泌细胞因子(CK)细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法具有较高的特异性和敏感性,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低,已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中,对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。 ELISPOT法源自ELISA,又突破传统ELISA法,是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白,它们最大的不同在于: (1)ELISA通过
3、显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。 (2)ELISPOT也是通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数,1个斑点代表1个细胞,从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。(某些研究不仅要测细胞因子生成量,还需检测分泌此细胞因子的细胞频率) 由于是单细胞水平检测,ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏,能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗,在研究者以刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌
4、细胞因子。 下面将从发展、原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。ELISPOT技术的发展(1)ELISPOT技术的过去 ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky等人率先在1983年,运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。从那时起世界各国免疫学者便开始一长期的ELISPOTCytokine技术竞赛,每个团队都希望能率先将此一技术推广来研究T细胞免疫,其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境,藉由侦测T细胞分泌的各类细胞因子,来定量机体内免疫反应启始者PrecursorT的clonalsize族群大小,同时预测体内免疫系
5、统即将进行的下游免疫反应。 ELISPOTCytokine技术虽说操作简单,但该技术并没能如预期地很快地被成功应用在exvivoT细胞功能研究。要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产生的第一个主要问题,便是灵敏度的提升,因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产量极少。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想,成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题,使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点,结果是敏感度不够、数据分析重现性低。这问题直到1996美国俄亥俄卅CaseWesternReserve大学PaulLehmann团队引进PVDF薄膜的应用(Forsthube
6、retal.,Science,1996),才釜底抽薪地解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比,PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体,使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏,让呈色斑点集中、清晰、对比色高,大大的提高ELISPOTCytokine分析的敏感度。图一是使用PVDF-BASED改良薄膜(PanelA)与传统标准薄膜(PanelB)并行实验的比较结果。同样的人体PBMC样品,在通过完全相同的实验,PanelA呈现较清晰的小色点。 第二个技术性问题是ELISPOTCytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实证,也
7、使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。没有科研人员尝试去厘清一些基础但很重要的问题,诸如; 实验所得的斑点是抗原特定T细胞所生产,还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效应? 斑点的小或大有何生理意义;如何决定cutoff值? 能否相信斑点是由单一的细胞造成? ELISPOTCytokine分析技术能准确测量的频率范围? 如果效应相互拮抗的cytokine同时产生,它们是否会互相妨碍?及到什么程度?(2)ELISPOT技术的现在 1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材篁
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