ELISPOT技术原理及其应用教学内容.ppt

《ELISPOT技术原理及其应用教学内容.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、ELISPOT技术原理及其应用1983年,Czerkinsky&Sedgwick：计数分泌抗体的B细胞；1985年，More：NC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶;1988年，Czerkinskyet.al.:首次将应用扩展到细胞因子检测领域，TcellIFN-γ;同年业发展出双色标记技术；1995年，Schielenet.al.:首次将PVDF膜板引入ELISPOT1997年，Guiet.al.：发展出计算机辅助的斑点技术技术。1.ELISPOT技术起源与发展T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞Th。它们参与了细胞免疫

2、(Th1)和体液免疫(Th2)抗原或者有丝分裂原刺激T细胞、单核/巨噬细胞分泌细胞因子Th1cellsIFN-γ,IL-2Th2cellsIL-4,IL-5,IL-6,IL-9,IL-10,IL-13TccellsIFN-γ,TNF-β,颗粒酶B，穿孔素单核/巨噬细胞TNF-a,IL-1b,IL-6,IL-10,IL-12细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免疫系统调节网络。2.细胞与细胞因子用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。3.ELISPOT技术原理4.ELISPOT和ELISA的区别ELISP

3、OT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同:ELISA测定的是蛋白浓度，ELISPOT测定的是细胞频率；（整体水平与单细胞水平）ELISA是免疫检测Immuno-Assay，而ELISPOT是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测）ELISA检测的特异性表现在抗体上，ELISPOT检测的特异性及表现在双重的刺激源和抗体上。5.ELISPOT的优点目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下几种：ELISA、ELISPOT、FACS、Tetram

4、er、3H胸苷参入法、51Cr释放法。高灵敏：度少至100－1,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。单细胞水平：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比FACS灵敏。高通量：每个研究人员每天可作数百样本的检测。HighThroughputScreening在106抗原呈递细胞（APC）中混入已知数量的IFN-γ阳性T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。X坐标：各检测方法的检测结果Y坐标：每百万APC中实际IFN-γ+T细胞数量ELISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较ELISPOT流式荧光染色ELISA第二部分：技

5、术特点技术操作流程ELISPOT技术要点塑料板与膜板膜结构与抗体包被细胞处理有血清与无血清刺激物选择建立阳性对照调整适当的细胞浓度预培养法与直接法各种染色系统包被抗体4℃过夜，洗涤；封闭37℃1h；加入淋巴细胞和刺激原37℃孵育8-40h；冰水裂解并移出细胞，洗涤；加入生物素标记的检测抗体37℃1h，洗涤；加入酶联亲和素37℃1h，洗涤；加入显色底物，显色10~40min；获得斑点，计数。1，23456781.ELISPOT一般操作流程2.ELISPOT技术要点细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关CO2

6、孵箱洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒的方式洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干塑料板：U-cytech公司特有的透明版操作简单，方便，省时，价廉，但是斑点不如膜板漂亮，适于初学者以及临床诊断。膜板：PVDF膜板、NC膜板操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者以及科学研究。3.塑料板与膜板塑料板：U-cytech公司特有的透明版优点：透明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞；可以快速包被，节省实验时间；可回收细胞和上清；价格只有PVDF膜板的一半。缺点：吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解；裸视下

7、斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显；只有一种染色系统，不能用于多色分析。修饰的HRP/银染系统膜板：PVDF膜，NC膜优点：PVDF膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润；斑点颜色鲜艳，易于判读；能用于多色ELISPOT实验。缺点：需酒精预湿等步骤，操作稍复杂；因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂；几乎不可能回收细胞和上清；膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。HRP/DABAP/BCIP&NBTHRP/AECIFN-IL-5IL-10IFN-PMA/ionomycin2.5x104hu-PBMCindirecttetanus105hu-PBMCindirec

8、tConA2.5x104hu-PBMCindirectICEPeptidePoo