应用elispot技术检测结核菌感染的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文应用ELISPOT技术检测结核菌感染的研究姓名：李峤珂申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：张广宇吴雪琼20070301中文摘要应用ＥＬＩＳＰＯＴ技术检测结核菌感染的研究摘要目的：建立应用酶联免疫斑点（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ．ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔＡｓｓａｙ，ＥＬＩＳＰＯＴ）技术检测结核菌感染的方法，初步研制酶联免疫斑点试剂盒（简称自制试剂盒），并评价其在结核病诊断临床中的应用价值。方法：选择３０例非结核感染志愿者，２６例结核病人和４例结核菌素纯蛋白衍生物（ＰＰＤ）皮肤试验强阳性、无任何结核病

2、临床症状且相关检查结果无异常的志愿者，用英国ＯｘｆｏｒｄＩｍｍｕｎｏｔｅｃ公司研制的ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒（简称ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒）检验。根据结核杆菌特异的效应Ｔ淋巴细胞在特异抗原的刺激下分泌Ｙ．干扰素（ＩＦＮ．Ｙ），检测ＩＦＮ．Ｙ可以确定体内是否存在对结核杆菌反应的效应Ｔ淋巴细胞的原理，建立应用ＥＬＩＳＰＯＴ技术检测结核菌感染的方法。预先用ＩＦＮ－７单克隆抗体包被９６孔硝酸纤维素膜板，用密度．梯度离心法分离被检测者外周血单核细胞，加入９６孔板中，用特异性重组ＥＳＡＴ－６蛋白和ＣＦＰｌ０．ＥＳ筒ｒ６融合蛋白刺激，活

3、化细胞，结核杆菌特异的效应Ｔ淋巴细胞将分泌ＩＦＮ－３’，然后加入生物素标记的ＩＦＮ－７多克隆抗体作为检测抗体，再加入碱性磷酸酶（ＡＫＰ）标记的链亲和素，加入底物ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液显色，在板底形成肉眼可见的深蓝色斑点。每一个斑点代表一个分泌ＩＦＮ－’ｙ的Ｔ淋巴细胞。根据体内是否存在结核杆菌效应Ｔ淋巴细胞，对结核杆菌感染进行辅助诊断。中文摘要改变不同的实验条件确定应用ＥＬＩＳＰＯＴ技术检测结核杆菌感染方法的最佳细胞浓度、孵育时间，蛋白浓度等，初步研制自制ＥＬＩＳＰＯＴ试剂盒。选择３２例非结核感染志愿者和３１例结核病人，均

4、使用ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒和自制试剂盒进行检验。将两者检测结果进行对比。结果：用ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒进行检验，３０例结核感染者的血样本检测结果９３．３％（２８／３０）阳性，６．７％（２／３０）阴性，３０例非结核感染者检测结果９６．６％（２９／３０）阴性，３．４％（１／３０）阳性。改变不同的实验条件来确定自制试剂盒的各个合适的实验条件，结果表明：２Ｘ１０５细胞密度较为合适，孵育时间２０ｈ为实验条件，刺激结核致敏Ｔ淋巴细胞的蛋白浓度２０“‖ｍｌ为实验条件。．用ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒和自制试剂盒对３２例非结核感染者和３１例

5、结核病人进行检测，结果９２．１％（５８／６３）ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒与自制试剂盒检测结果相同，７．９％（５／６３）结果不同。对两种试剂盒检出结果行Ｘ２检验，两者差异无显著性（Ｐ＞０．０５），说明两种试剂盒对血样阳性检出率没有显著性差异。３１例已确诊结核病人检测结果为ｔＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒８７．１％（２７／３１）阳性，自制试剂盒９０．３％（２８／３１）阳性。３２例非结核感染者检测结果为：ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒１８．８％（６／３２）阳性，自制试剂盒２５．Ｏ％（８／３２）阳性。自制试剂盒的敏感性略高于ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒

6、。自制试剂盒的假阳性率高于后者，但因所选病历中包括消化系统和血液肿瘤患者，以及老年人等免疫低下者，不排除其为结核潜伏感染者，因机体免疫力低下，对ＰＰＤ实验无反应。故尚需进一步的追踪阳性病中文摘要例是否发病。自制试剂盒痰菌阳性组检测孔内斑点数显著高于痰菌阴性组检测孔（Ｐ＜０．０５），说明痰菌阳性患者体内特异性ＩＦＮ－Ｙ分泌细胞数有不同程度提高。结论：英国ＯｘｆｏｒｄＩｍｍｕｎｏｔｅｃ公司研制的ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒诊断结核病感染者的敏感度和特异性均较高；本研究建立了一种结核病细胞免疫诊断试剂盒，其诊断结核病感染者的敏感性

7、和特异性与ＴＳＰＯＴ－ＴＢ试剂盒相似，且操作简便，花费小；ＥＬＩＳＰＯＴ在检测结核潜伏感染者敏感性和特异性均高于ＰＰＤ皮肤试验。关键词：结核；诊断；Ｙ．干扰素；酶联免疫斑点法（ＥＬＩＳＰＯＴ）．英文摘要ＳｔｕｄｙｓｏｎｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｂｙｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ·ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）ｍｅｔｈｏｄＡＢＳＴＲＡＣＴｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ

8、ｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｂｙｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）ａｎｄｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅａｋｉｔｏｆＥＬＩＳＰＯＴ．Ｅｖａｌｕｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆｓｅｌｆ－ｍａｄｅｋｉｔｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｏｓｅｌｅｃｔ３０ｈｅａｌｔｈｙｖｏｌｕ