elispot技术在乙型肝炎病毒(hbv)感染研究中的应用

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1、ELISPOT技术在乙型肝炎病毒（HBV）感染研究中的应用首都医科大学附属北京佑安医院闫惠平研究员，博士生导师MargolisHSetal.SeminLiverDis1991;11:84–92.乙肝病毒携带者流行分布(3.6亿慢性乙肝病毒携带者):<2%–低流行区2–7%–中度流行区>8%–高流行区乙肝病毒携带者的流行分布HBsAg流行率在中国的地区分布江西山西重庆HBsAg流行率黑龙江吉林辽宁内蒙古北京天津河北山东江苏上海浙江台湾福建广东海南广西云南贵州四川西藏新疆青海甘肃宁夏陕西河南湖北湖南安徽19

2、92年全国病毒性肝炎血清流行病学调查8%高流行区2%~7%中度流行区HBV携带者全球性分布HBsAg携带者的分布<1%1-10%>10%少见HCC每年发病率每100,000人1-33-1010-150少见HBV携带者地理分布与肝细胞癌(HCC)发病率HBV感染的流行情况及其严重性•全世界HBV感染者:3.6亿•中国HBV感染者:1.3亿(2004年流行病学调查，HBsAg阳性率为8.22％,接种乙肝疫苗人群为4.51％，非免疫人群为9.51％)。•慢性乙型肝炎:3000万-5年后，约12%-25%

3、发展为肝硬化,约20％-23%发展为失代偿肝硬化。约6%-15%肝硬化可发展为肝细胞癌(HCC)-国内80%肝细胞性肝癌与HBV感染相关•每年死于乙肝相关肝病及肝癌约30-50万人AdaptedfromFeitelson.LabInvest,1994,andfromEASLConsensusStatement.JHepato,2003,39(S1):S3-25HBVinfection急性肝炎慢性肝炎重型肝炎（急性、亚急性、慢性）慢性HBV携带者乙肝后肝硬化原发性肝癌隐性感染(既往感染)HBV实验室诊断生化

4、：ALT，AST，Tbil，ALP，TP等凝血：病原学检测：HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBcHBVDNA缺少细胞免疫功能监测指标ELISPOT---细胞免疫学技术从单细胞水平检测分泌抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞,从单细胞水平评价机体的细胞免疫或体液免疫功能不仅适用于特异性T细胞应答的检测也可用于特异性B细胞应答的分析ELISPOT技术的应用疫苗研究HBV疫苗：疫苗的免疫原性；疫苗的治疗效果；疫苗的给药途径；不同病人的敏感性肿瘤疫苗：抗肿瘤甲胎蛋白和热休克蛋白DNA疫苗；肝癌疫苗

5、；抗原表位筛选：丙肝CTL表位；用肽库筛选T细胞表肽；自身免疫病研究、诊断器官移植肝移植：肝移植免疫耐受;ELISPOT--在HBV细胞免疫中的应用抗原表位肽的筛选,某些肽段有保护作用?感染后细胞免疫功能的检测,判断乙肝病人在病程中所处的免疫状态（急性期、平稳期、耐受期、恢复期）,是否具有清除病毒的能力?抗病毒治疗疗效监测,有无应答?停药后是否会反跳等;器官移植后排斥反应的预测。--------但是目前能够清楚说明临床问题的报道很少乙肝病毒HBV的感染及复制过程HBVcccDNA每个感染肝细胞核中含30~

6、40cps，形成稳定的cccDNA池(Minichromosome)当前尚无任何药物能直接作用于cccDNA抑制HBV复制的药物即使长期应用很难清除cccDNABlackbergJetal.JHepatology2000;33(6):992KomoriMetal.JHepatology2001;35(6):798LewinSetal.AntiviralResearch2002;55:381佑安医院初步研究研究目的通过观察乙型肝炎病毒（HBV）特异性多肽刺激外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN-γ的能力，

7、分析慢性乙型肝炎患者、慢性乙型重型肝炎患者及隐性感染者体内特异性T细胞免疫应答的差异和作用。材料和方法病例分组慢性乙型肝炎组（CHB）20例慢性乙型重型肝炎组（CSH）10例正常对照组1（N1，隐性HBV感染者）6例正常对照组2（N2，正常献血员）10例研究方法合成四条HLA-A2限制的HBV特异CTL抗原表位肽作为刺激抗原。表面抗原蛋白Te28-39（简称Te1）表面抗原蛋白Te183-191（简称Te2）多聚酶蛋白Tp573-581（简称Tp）核心抗原蛋白Tc18-27（简称Tc）采用酶联免疫斑点（E

8、LISPOT）技术检测抗原表位特异性T细胞的免疫应答功能。结果1：HLA-A2基因表型检测结果HLA-A2基因表型检测结果（流式细胞技术直接免疫荧光法）左图为HLA-A2阴性结果，右图为HLA-A2阳性结果结果2：抗原特异性CTL应答功能检测结果及分析ELISPOT实验结果图抗原特异性CTL对肽的反应结果只要对任何一条肽刺激产生IFN-γ的阳性斑点者即计为反应阳性者。CHB组，阳性率为50%（10/20）CSH组，阳性率为10