实验三普通光学显微镜的使用及革兰氏染色方法庞昕.ppt

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1、实验三普通光学显微镜的使用及革兰氏染色方法庞昕一、实验目的及要求复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。学习微生物制片、染色的基本技术，掌握革兰氏染色方法。初步认识细菌的形态特征。了解细菌的革兰氏染色原理及其在细菌分类鉴定中的重要意义。二、实验原理1.显微镜的构造光学部分:目镜、物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。它使检视物放大,生成物像。二、实验原理机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节和固定等作用。2.

2、油镜头的辨认：油镜头有OI(oilimmersion)或HI（homogeneneousimmersion）字样，其放大倍数和数值孔径最大，而工作距离最短。3.油镜使用的原理：当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。二、实验原理显微镜的放大倍数和分辨率1.放大倍数：物镜放大倍数×目镜放大倍数2.显微镜的分辨率:是表示显微镜辨析两点之间距离的能

3、力。可用公式表示为：D=λ/2n·sin(α/2)式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰二、实验原理显微镜保养和使用中的注意事项:1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.拿显微镜时，一定要右手拿

4、镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。二、实验原理二、实验原理简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的染色方法。常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料电离时，其分子染色部分带正电荷，能和带负电荷的物质结合。由于细菌生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称

5、复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，

6、因此细菌仍保留初染时的颜色。二、实验原理二、实验原理细菌细胞壁的结构三、实验器材1、菌种：枯草杆菌（Bacillussubtilis），大肠杆菌（Escherichiacoli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）2、染色液和试剂：吕氏碱性美兰染液、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红、二甲苯、香柏油3、器材：显微镜、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、废液缸四、实验方法1、简单染色：（1）涂片：注意取菌不要太多。（2）晾干：自然晾干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以

7、不烫手为宜）（4）染色：涂片加美兰染色1-2min。（5）水洗：水洗背冲涂片（6）干燥：自然晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，油观察细菌的形态。2、革兰氏染色（1）制片：制片方法与简单染色相同。（2）初染：加适量（以刚好覆盖菌膜为宜）的结晶紫染色液染色1－2min，水洗。（3）媒染：碘液媒染1min，水洗。（4）脱色：连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。（5）复染：滴加番红复染2min，水洗。（6）镜检：干燥后，油镜镜检观

8、察。（7）混合涂片法：三区法染色五、实验报告给出枯草杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌形态图，并注明其革兰氏染色反应。六、注意事项（思考题）1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。2.染色