实验三. 显微镜的使用,细菌单染色及革兰氏染色

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1、6实验三.显微镜的使用，细菌单染色及革兰氏染色------10级生命基地史倩201005140081一．目的要求：1.学习显微镜（特别是白色圈标记的油镜）的使用方法2.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术3.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征4.了解革兰氏染色原理，并掌握其方法二．实验器材：1.菌种大肠杆菌（Escherichiacoli）,枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）,金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），自制菌种2.溶液和试剂革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢

2、戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，95%的乙醇等。3.仪器和其他用品酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯）,擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片架子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。三．实验原理：1.油镜的使用：在普通光学显微镜的通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大（性能与分辨率最高），对微生物的研究很重要！油镜头长度大于低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线或白线，并刻有100×、1.25或oil等字样。其使用方法特殊——需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这有两方面的原因：a.增加

3、照明度：油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显现不清。若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），则使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。b.增加显微镜的分辨率2.值得指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。还需经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。平板划线分离法即为一种常用的分离纯化过程。平板划线分离法的步骤：a.倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加

4、热融化，冷至55~60℃时，在火焰旁，用左手持培养皿（皿盖打开一小缝），迅速倒入培养基约15mL。加盖后轻轻摇动，使培养基均匀分布在培养皿底部，后平置于桌面之上，待凝后即为平板。b.划线:再近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取自选菌种在平板上划线（平行线之间距离小，使划线次数增加）。划线方法多样，其目的是通过划线将样品在平板上进行稀释，培养后形成但菌落。6a.及时灼烧接种环上剩余的菌体1.涂片法：对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹使细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固

5、定，使其细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上。这种加热处理可以杀死大部分细菌而且不破坏细胞形态。2.简单染色：利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于染色的物质为一类苯环上连着发色基团或助色基团的有机化合物。发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使其形成盐。只有发色基团而无助色基团的苯化合物（色原）即使有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，难以与细胞结合而染色。常用的微生物染料都是盐，分碱性染料（美蓝-亚甲蓝，结晶紫，碱性复红，沙黄-番红，孔雀绿)和酸性染料（酸性复红，伊红，刚果红）。通常采用

6、碱性染料进行简单染色，因为微生物细胞在碱性，中性及弱酸性的环境中多带有负电荷，而染料电离后染色部分带正电性，易相互结合。当细胞处于酸性条件时（如分解糖类产酸）所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。3.革兰氏染色法：可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。首先是制片，取活跃期的菌种按常规的涂片方法涂片干燥，固定。再利用草酸铵结晶紫初染，染色1~2分钟，水冲洗至水无色，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理（冲去水迹，再用碘液覆盖

7、1分钟），由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂精心处理时，两种细菌的脱色效果不同。用水冲洗至无色，再用番红染色2分钟，干燥后镜检。革兰氏阳性细菌(如Staphylococcusaureus)细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌（如Escherichiacoli）细胞壁肽聚糖含量低，

8、交联度低，避薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红色）。一．实验内容：1.显微镜的构造与使用：a.取放-----双手托着显微的镜壁与镜座b.对光-----调节光圈，转换器及平凹面镜，双目镜要调节目间距至一个圈c.低倍镜观