光学显微镜的使用及革兰氏染色

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1、光学显微镜的使用及革兰氏染色显微镜是研究微生物所必不可少的工具。由于显微镜的发明，帮助人类揭开了微生物世界的奥秘。随着科学技术的不断发展，光学显微镜已从利用可见光的范围扩大到利用紫外光源及非光源的电子显微镜，从而大大地提高了显微镜的放大率和分辨率。当今微生物学实验室中最常用的是普通光学显微镜，无论是观察微生物的个体形态还是测量微生物细胞大小都必须使用它。因此我们应了解显微镜的构造和原理，以达到正确使用和保养的目的。除暗视野显微镜和相差显微镜可用于观察活的细菌细胞外，其他普通光学显微镜大都用来观察经染色后的细菌细胞，只有经过染色的细胞才能

2、看清其形态和构造。因此各种染色法也是微生物工作者应掌握的基本技术。1普通光学显微镜的使用【目的】1．了解普通光学显微镜的构造和原理。2．正确掌握使用显微镜的方法。【概述】微生物是肉眼看不见的微小生物，必须借助光学显微镜和电子显微镜，才能观察到。因此，显微镜是研究微生物最基本和最重要的工具之一。所以，掌握显微镜的使用与维护是进行微生物实验研究的基本技能。【普通光学显微镜的基本结构】普通光学显微镜由两大部分组成，即机械部分和光学部分。机械部分包括镜座、镜臂、载物台及台上的标本推进器、镜筒、物镜转换盘、升降调节器等，其主要作用是支撑、固定镜头

3、、调节物象焦距、搁置和移动标本。光学系统包括反光镜（或电光源）、光圈、聚光器、物镜、目镜等，作用是收集光源并聚集于标本上，然后通过透镜放大成像，使人眼可以分辨在裸眼时不能看见的细节。物镜一般有4×、10×、40×、100×（或90×）等几种。100×的是油镜，是微生物实验最常用的物镜。因为目镜多为10×，所以使用油镜观察标本时，放大倍数为1000×，可以将1μm左右的细菌放大至1mm左右。1．机械装置(1)镜座和镜臂：它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微镜的作用。直筒显微镜的镜臂与镜座之间有一倾斜关节，可使显微镜倾斜一定的角度便于观

4、察。(2)镜筒：它是一个金属制的圆筒，其上端安放目镜，下端安装转换器，镜筒的长度是固定的，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度是可调节的。(3)转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，其上可装3-4个物镜。为使用方便，物镜应按低倍到高倍的顺序安装。转换物镜时，必须用手按住圆盘旋转，勿用手指直接推动物镜，以免使物镜和转换器间的螺旋松脱而损坏显微镜。(4)镜台：用于安放玻片。镜台上安装有玻片夹或玻片移动器，调节移动器上的螺旋可使标本前后、左右移动，有些移动器上还装有刻度标尺，可标定标本的位置，便于重复观察。目镜物镜转换器物镜标本推进器载物台光

5、圈集光器反光镜镜座标本推进器旋钮细调节轮粗调节轮镜臂普通光学显微镜的结构(5)调焦装置：调焦装置即安装在镜筒后方两侧的粗螺旋和细螺旋，用于调节物镜和标本间的距离，使物像更清晰。粗螺旋转一圈可使镜筒升降约10mm，细螺旋旋转一圈可使镜筒升降约0.1mm的距离．2．光学系统(1)目镜：目镜的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜由两片透镜组成，上面一块为接目透镜，下面一块为聚透镜，两片透镜之间有一光阑。光阑的大小决定了视野的大小，光阑的边缘就是视野的边缘，故又称视野光阑。由于标本正好在光阑上成像，因此在光阑上粘一小段细发作为指针，可用来指示标

6、本的具体部位。光阑上还可放置测量微生物大小的目镜测微尺。目镜上标有5x、10x、15x等放大倍数，不同放大倍数的目镜其口径是统一的，可互换位用。(2)物镜：是显微镜中最重要的部件。物镜有低倍(10x以下)、中倍(20x)、高倍(40-65x)和油镜(90x以上)等不同的放大倍数。油镜简上刻有“OI”或“HI”字样，也有刻一圈红线或黑线为标记的，借以区别于其他物镜。物镜上标有放大倍数、数值孔径(numericalaperture,简写为NA)、工作距离(物镜下端至盖玻片间的距离，mm)及要求盖玻片的厚度等主要参数。数值孔径系指介质的折射率

7、与镜口角1／2正弦的乘积，可用NA=nsinα/2表示。式中，n为物瓷与标本问折射率，α为镜口角(通过标本的光线延伸到物镜前镜边缘所形成的夹角。显微镜的优劣主要取决于物镜分辨力的大小。所谓分辨力就是显微镜工作时分辨出两点间最小距离(D)的能力。D值愈小表明分辨力愈高。D值可用下列公式表示。D=0.61λ/NA要提高物镜的分辨力有两条途径①缩短光的波长。普通光学显微镜的缺点是所用的照明光源不可能超过可见光的波长范围(约400—770ｎｍ)。②增大物镜的数值孔径。其影响因素之一是镜口角α，当sinα增大到最大时，α值＝90°，就是说进入透镜

8、的光线与光轴成90°角，这是不可能的，所以sinα/2的最大值总是小于1。现在所用的油镜其α为60°左右。影响数值孔径的另一因素是介质的折射率，不同介质的折射率是不同的，空气的折射率为1.0，水的折射率为1