最新第一法大肠菌群MPN 计数讲解学习.doc

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1、第一法大肠菌群MPN计数 操作步骤 6.1、样品的稀释 6.1.1、固体和半固体样品：称取25g样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，800or/min-10000r/min均质1min-2min，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。 6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10的样品匀液。 6.1.3、样品匀液的pH值应在

2、6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。 6.1.4、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。 6.2、初发酵

3、试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）,36℃±1℃培养24h±Zh，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 6.3、复发酵试验 用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气

4、者，计为大肠菌群阳性管。 6.4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告 根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录B)，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。第二法大肠菌群平板计数 8、操作步骤 8.1、样品的稀释 按6.1进行。 8.2、平板计数 8.2.1、选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1ml。同时分别取1ml生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。 8.2.2、及时将15mL-20ml冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3m

5、L-4mlVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃培养18h-24h。 8.3、平板菌落数的选择 选取菌落数在30-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。 8.4、证实试验 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h-48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 8.5、大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，

6、再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。第三法大肠菌群PetrifilmTM测试片法 10、操作步骤10.1样品的稀释 按6.1进行。 10.2、测定 10.2.1、样品接种及培养 将待检样品选取2个-3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两张测试片。将PetrifilmTM大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取1ml样液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下。把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1min以

7、使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，36℃±1℃培养24h±2h。 10.2.2、判读 培养24h±Zh后应立即计数，可目测或用标准菌落计数器、放大镜或PetrifilmTM自动判读仪来计数。红色有气泡的菌落确认为大肠菌群。圆形培养区边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡，大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明大肠菌群的浓度较高，需要进一步稀释样品以获得更准确的读数。 10.3、大肠菌群测试片计数的报告 选取菌落数在15-150之间的测试片，计数其红色有气泡的菌落数，两个测试片的平均菌落

8、数乘以稀释倍数即为每克（或毫升）样品中的大肠菌群菌落形成单位（CFU）数。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌