第一法大肠菌群MPN 计数

《第一法大肠菌群MPN 计数》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第一法大肠菌群MPN计数操作步骤6.1、样品的稀释6.1.1、固体和半固体样品：称取25g样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，800or/min-10000r/min均质1min-2min，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3、样品匀液的pH值应在6.5

2、-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。6.1.4、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2、初发酵试验每

3、个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）,36℃±1℃培养24h±Zh，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。6.3、复发酵试验用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计

4、为大肠菌群阳性管。6.4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录B)，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。第二法大肠菌群平板计数8、操作步骤8.1、样品的稀释按6.1进行。8.2、平板计数8.2.1、选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1ml。同时分别取1ml生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。8.2.2、及时将15mL-20ml冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL-4mlVRB

5、A覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃培养18h-24h。8.3、平板菌落数的选择选取菌落数在30-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。8.4、证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h-48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.5、大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每

6、克（或毫升）样品中大肠菌群数。第三法大肠菌群PetrifilmTM测试片法10、操作步骤10.1样品的稀释按6.1进行。10.2、测定10.2.1、样品接种及培养将待检样品选取2个-3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两张测试片。将PetrifilmTM大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取1ml样液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下。把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1min以使培养基凝固。将测试片的透明

7、面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，36℃±1℃培养24h±2h。10.2.2、判读培养24h±Zh后应立即计数，可目测或用标准菌落计数器、放大镜或PetrifilmTM自动判读仪来计数。红色有气泡的菌落确认为大肠菌群。圆形培养区边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡，大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明大肠菌群的浓度较高，需要进一步稀释样品以获得更准确的读数。10.3、大肠菌群测试片计数的报告选取菌落数在15-150之间的测试片，计数其红色有气泡的菌落数，两个测试片的平均菌落数乘以稀释倍数即为每克（或毫升

8、）样品中的大肠菌群菌落形成单位（CFU）数。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘