降胆固醇菌株筛选方法

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1、降胆固醇菌株筛选方法1．培养基（1）YEPD液体培养基，用于酵母菌的活化。（2）改良Kenji的培养基组成盐溶液Ⅰ：酵母酶解粉0.2g，蛋白胨0.4g，KH2PO40.25g，MgSO4·7H2O0.25g，FeSO4·7H2O5mg，NaCL5mg，蒸馏水1000mL。可加入1mL·L-1的2%溴百里香草酚兰作指示剂。pH自然，121℃灭菌20min。胆固醇的溶解：取N，N-二甲基甲酰胺10mL，吐温-800.5mL，胆固醇0.5g，加入到试管，121℃灭菌20min。应用时将以上助溶胆固醇加热融化，无菌操作取100μl加入到灭菌盐溶

2、液Ⅰ的试管中（5mL），混匀。（胆固醇浓度0.1%）。2．纯化菌株的筛选（1）纯化酵母菌株的初筛分离培养基为加了10g酵母膏的土豆培养基。液体培养物的制备用液体PDA培养基，不加酵母膏。酵母菌YEPD液体培养物制备：180mm大试管装50mYEPD液体培养基，至少每株菌准备一瓶，121℃灭菌后，分别接种分离出来的酵母菌菌株。28±2℃培养24h。无菌操作取各酵母菌发酵液，测定其在600nm处的吸收值。测定后，将发酵液统一用灭菌的YEPD培养基进行稀释，要求稀释后所有发酵液的OD560nm值一致（考虑操作简便性，在下一步接种可不稀释而是根

3、据菌体浓度按比例接种）。（保证OD600nm在0.2-0.8范围内）初筛：按3%(v/v)接种量将上述酵母菌YEPD液体培养物，接种于加了溴百里香草酚兰指示剂（1ml/1000ml2%）的改良Kenji的培养液（培养液装量5/管）中，每个菌株做两个重复，如此再传代2-3次，进行富集增菌培养。比较其生长（变色）速度（每天观察，初步确定培养时间）、发酵液浊度（OD600nm），初步判定各菌株利用胆固醇的能力。将初筛发酵液中的各菌株分别划线接种于含碳酸钙的YEPD双层平板上，并同时做后续复筛试验。(2)降解胆固醇酵母菌的复筛取初筛发酵液100

4、μL（根据初筛发酵液OD值确定接种量），接种于改良Kenji的培养液（不需要加酸碱指示剂，培养液装量5管）中，培养36-72h，将菌液用蒸馏水适当稀释，在600nm波长测定其光密度，以OD值表示其相对生长量（用未接菌的改良Kenji的培养液稀释液调节分光光度计的0和100）。并测定其发酵前和发酵后培养液的胆固醇含量，计算其降解率。胆固醇含量的测定，采用邻苯二甲醛法比色法。胆固醇降解率（%）=（发酵前胆固醇含量—发酵后胆固醇含量）/发酵前胆固醇含量×100%。(3)筛选出降解胆固醇酵母菌的保存将复筛发酵液中的各菌株分别划线接种于含碳酸钙的

5、YEPD双层平板上。待菌落长出后，将碳酸钙溶解圈大的菌株接种于YEPD培养基斜面上，4℃冰箱保存。3．酵母菌降解胆固醇特性研究（模拟人体胃肠环境）经初筛和复筛试验，优选出1-2株降胆固醇能力强的菌株。（1）酵母菌的活化用接种环从保存的或复筛发酵液蘸取适量菌体细胞，接种至YEPD液体培养基中28℃恒温培养24h后，再用移液管移取1ml培养液于新的YEPD液体培养基中28℃恒温培养24h，如此重复两代，使酵母菌活化。（2）酵母菌降胆固醇特性研究将活化好的菌株按10%（v/v）接种至不同pH的PBS缓冲液中（模拟胃环境），37℃保温4h后，将

6、此含菌缓冲液按10%（v/v）接种至含不同胆盐浓度（模拟肠道环境）的改良Kenji的培养液中，37℃培养24h后，测定其发酵前和发酵后菌体及培养液中的胆固醇含量，计算其降解率。表1培养液胆固醇降解率模拟人体消化道环境培养前培养液培养后培养液培养液胆固醇降解率胃环境肠道环境OD560nmOD560nmpH1.5PBS0.1%胆盐24h0.2%胆盐24h0.3%胆盐24hpH2.5PBS0.1%胆盐24h0.2%胆盐24h0.3%胆盐24hpH3.5PBS0.1%胆盐24h0.2%胆盐24h0.3%胆盐24h表2菌体胆固醇富集情况模拟人体消

7、化道环境培养前菌体培养后菌体菌体胆固醇累计量胃环境肠道环境OD560nmOD560nmpH1.5PBS0.1%胆盐24h0.2%胆盐24h0.3%胆盐24hpH2.5PBS0.1%胆盐24h0.2%胆盐24h0.3%胆盐24hpH3.5PBS0.1%胆盐24h0.2%胆盐24h0.3%胆盐24h