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《基于t7 表达系统的洋葱伯克霍尔德菌g63 脂肪酶同源》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、生物工程学报ChinJBiotech2009,February25;25(2):215-222journals.im.ac.cnChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061cjb@im.ac.cn©2009InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,Allrightsreserved工业生物技术基于T7表达系统的洋葱伯克霍尔德菌G63脂肪酶同源高效表达贾彬,杨江科,闫云君华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室,武汉430074摘要:为实现对洋葱伯克霍尔脂肪酶的可控高效表达,将目前被广泛使用的T7重组
2、蛋白高效表达系统移植到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)G63中进行脂肪酶同源表达。首先采用PCR从大肠杆菌BL21(DE3)中得到T7RNA聚合酶基因(T7RNAP)并将其克隆到致死质粒pJQ200SK上,然后在T7RNAP前后各加入500bp用于同源重组的片段,再通过三亲本杂交把T7RNAP整合到B.cepacia基因组上,使T7RNAP受到脂肪酶基因(lipA)启动子调控。接着把lipA和它的伴侣基因lipB单独或全部克隆到载体pUCPCM和pBBR22b上,构建出pBBR22blipAB、pBBR22blipA、pUCPCMlipAB、pUCPC
3、MlipA、pUCPCMΔlipAlipB、pUCPCMΔlipA、pUCPCMΔlipB七种表达质粒,通过电转化将上述表达质粒转化到含T7RNAP的B.cepacia宿主菌中,最终得到一系列脂肪酶基因工程菌。通过摇瓶诱导发酵发现含表达质粒pUCPCMlipAB的工程菌脂肪酶酶活最高,达到607U/mg,与野生菌相比酶活力提高2.8倍,并且除含pUCPCMΔlipB的工程菌外,其它工程菌的脂肪酶酶活均有不同程度提高。野生菌与工程菌pUCPCMlipAB的发酵液经硫酸铵沉淀,SephadexG-75凝胶过滤纯化后,比酶活分别为29984U/mg和30875U/mg。以上结果表明,
4、构建的基于T7表达系统的B.cepacia脂肪酶基因工程能有效提高脂肪酶的表达量,同时说明分泌信号PelB和增强转录的核糖体接合位点对脂肪酶的表达有促进作用。关键词:T7RNA聚合酶表达系统,同源表达,三亲本杂交,洋葱伯克霍尔德菌G63HomologousexpressionofBurkholderiacepaciaG63lipasegenebasedonT7RNApolymeraseexpressionsystemBinJia,JiangkeYang,andYunjunYanKeyLaboratoryofMolecularBiophysicsofMinistryofEduca
5、tion,CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430074,ChinaAbstract:Inordertorealizeover-expressionofBurkholderiacepacia(B.cepacia)lipase,weintroducedthewidelyusedT7RANpolymeraseexpressionsystemintoB.cepaciaG63toover-expressthelipasegene.ByusingPCRtechni
6、que,weamplifiedtheT7RNApolymerasegene(T7RNAP)fromtheBL21(DE3)andcloneditintothesuicideplasmidpJQ200SK.Afterthat,weflankedT7RNAPwithtwo500bphomologousfragmentsandintegrateditintothegenomesofB.cepaciabytri-parentalmating,sothatT7RNAPwasunder-controlledbylipasegene(lipA)promoter.Then,weclonedth
7、elipAanditspartnergenelipBintothevectorReceived:September17,2008;Accepted:November28,2008Supportedby:theNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(863Program)(Nos.2006AA020203,2007AA05Z417,2007AA100703),ProgramforNewCenturyExcellent
