间充质干细胞的传代说课讲解.ppt

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1、间充质干细胞的传代二、实验材料、试剂与器材1材料：100-150gSD大鼠。2试剂：乙醚，75%酒精，L-DMEM低糖培养基，胎牛血清，小牛血清，Percoll细胞分离液，1.5MNaCl溶液，0.25%胰酶，FITC标记的羊抗鼠CD29抗体，FITC标记的羊抗鼠CD90抗体，FITC标记的羊抗鼠CD71抗体，PE标记的羊抗鼠CD106抗体，FITC标记的羊抗CD45抗体，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，Hoechst33258，油红O，20g/L硝酸钴溶液，20g/L硫化铵，50%甘油，多聚赖氨酸（PLL）。3仪器：细胞培养箱，微量移液器，倒置相差

2、显微镜，细胞培养皿，荧光显微镜，电子天平，pH计，离心机，超净工作台，电热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽，超声波清洗机，立式压力蒸汽灭菌器。三、实验原理间充质干细胞最早发现于骨髓中，其具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，约为0.01%。分离间充质干细胞的方法主要有三种：①全骨髓贴壁培养法；②密度梯度离心法；③根据间充质干细胞的表面标志，利用流式细胞仪进行分选。在本实验中所用的是密度梯度离心法，即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分离、经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞、分离获得MSC的纯度达到90%左右。间充质干细

3、胞没有特异性表面抗原，表达CD29、CD44、CD71、CD90等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志抗原。本实验选择了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45进行检测。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自发分化，在体外特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞，脂肪细胞等多种中胚层来源的细胞，不仅如此，它还可跨胚层分化为神经元细胞，胰岛细胞等。（一）骨髓间充质干细胞的原代培养1.取体重100-150g的大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75%的酒精浸泡消毒5min。2.将大鼠腹部朝

4、上，四肢用注射器针头固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，镊子将两后肢皮肤剪开，换另一套剪刀、镊子分离肌肉、肌腱，将股骨、胫骨剥离出来，放入装有75%酒精的烧杯中，移入超净台。3.将胫骨、股骨取出放入培养皿中加入10mlPBS缓冲液，用洁净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。4.将剥离干净的骨头用少量PBS冲洗后，放入另一培养皿，加入12mlDMEM完全培养基，在培养基中剪断骨干两端，用2ml注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打使骨髓分散，制成均匀的细胞悬液。5.另取一干净离心管A，加入10mlPercoll分离液。将吹打均匀

5、的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入，切记不能冲破Percoll分离液面，用8mlDMEM完全培养基冲洗培养皿，后用同样的方法将其加入离心管A。6.2500~3000r/min，离心30min后，可见离心管A中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管B，切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。7.将20mlPBS加入离心管B，反复吹打混匀，1800r/min离心10min。8.弃上清，重复步骤7。9.弃上清，加入5ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。【实验结果与分析】每天注意观察培养的

6、原代细胞的形态，并拍照记录。【思考题】1、密度梯度离心法的原理是什么？2、间充质干细胞的原代培养过程是什么，有哪些方面是需要注意的？(二)间充质干细胞的传代、冻存及复苏1.当细胞融合度达到90%左右时，将培养液吸出，加入PBS冲洗细胞两次。2.加入0.25%的胰酶2ml，置于37℃培养箱中2~3min，取出在显微镜下观察，当80~90%的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，移入超净台。3.传代：加入3mlDMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200r/min，离心10min。弃上清，加入10ml培养基吹打混匀。接种于两个

7、培养瓶中。4.冻存：加入3mlDMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200r/min，离心10min。弃上清，加入1ml冻存液（FCS：DMSO：L-DMEM=2：1：7）吹打混匀，置于冻存管中，4℃放置30~40min，-20℃放置1h，-80℃过夜，再移入液氮罐中。1.复苏：1)将细胞从液氮中取出，37℃轻微摇晃，使细胞快速融化。2)75％酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中，加入5ml培养基，1000r/min离心5min。3）弃上清，加入5ml完全培养基混匀细胞，接种于25cm2培养瓶中。【实验结果与分析】试述

8、细胞传代培养的、冻存及复苏的过程，以及各环节的注意事项。【思考题】1、细胞传代培