细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响

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1、维普资讯http://www.cqvip.com论著细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响霍建忠陈峥嵘(复旦大学附属中山医院骨科上海200032)【摘要l目的观察在成软骨诱导培养条件下，细胞传代对骨髓闻充质干细胞(MSCs)体外成软骨能力的影响。方法不同代MSCs成软骨诱导后，观察细胞生物学特性以及通过免疫荧光、RT—PCR测定特异性软骨细胞外基质aggrecan的表达情况。结果经成软骨诱导后，第2、4代MSCs表达aggrecan明显较第6、8代细胞高。结论MSCs很可能由多种形态功能接近，分化潜能有略有差异的

2、细胞组成；在成软骨诱导培养条件下，对此传代后成软骨能力减弱。【关键词l骨髓问充质干细胞II型胶原蛋白成软骨诱导【中图分类号lR329．2Il文献标识码lA【文章编号ll674-0742(2008)01(C)-0006-02组织工程方法修复关节软骨缺损及退行性变是目前的研究热点和1．2．1甲苯胺兰染色取P0、2．4、6、8代MSCs以l重点，而其他方法疗效均不显著仁Itl。随着细胞生物学的发展，尤×l0／cm，行细胞爬片，设立空白对照，成软骨诱导2周后行甲其是干细胞研究的飞速进展，使具有多向分化潜能的骨髓间充质干苯胺兰染色

3、，光镜下观察。细胞(mesenehymal：temCells，MSCs)成为组织工程方法修复关节软1．2．2测定细胞代谢活力将MSCs以l×l0接种干％孔培养骨缺损的重要种子细胞来源I。MSCs具有自我更新．多向分化潜板中，按上述方法每孔加入100L成软骨诱导液，每日干同一时间点能，可以分化成骨I、软骨14-6I、脂肪⋯和肌肉【I等细胞；并且易于获取5孔，每孔加人l0LCCK一8溶液(CeIICountingKit一8)作用取，能够在体外大量无限增殖I。研究⋯显示，MSCs可以在一2h，在酶标仪中读取450nm的吸光度值

4、(，参考波长为600nm，定的条件下分化成软骨细胞，表达特异性软骨细胞外基质一胶原蛋白取平均值，绘制曲线。相应代数未诱导MSCs对照。Ⅱ(CollagenⅡ)、aggrecan等；而将MSCs负载于纤维连接蛋白涂布的1．2．3RT—PCR检测aggreean的表达取P0、2．4、6．8羟基磷灰石小管中，植入裸鼠皮下后，能够生长出软骨组织l121；然代MSCs按上述成软骨诱导方法种植干6孔培养板的5：fL中，另l孔为阴而，组织工程用MSCs需先在体外成软骨细胞诱导、大量扩增后，负性对照组，成软骨诱导2周后，按lmL／l(~

5、n2}／1人T刚ZOLREAGENT载于一定载体植人体内修复软骨缺损。在成软骨诱导培养条件下，不(Invitrogen公司)抽提mRNA。采用TaKaRaRNAPCRKit同代MSCs的自我更新、向软骨细胞分化能力是否会有改变，尚未见(TaKaRa)，逆转录后PCR反应检测aggrecanmRNA的表达，PCR报道。我ff】将MSCs在成软骨诱导条件下培养，观察不同代细胞的生反应条件：94E，2minI94E，30sI6013，30sI72E，4min；共30个物学特性以及aggrecan的表达，探索MSCs在成软骨诱导

6、培养条件下循环；72E，10min。GAPDH作为内参。引物序列：aggrecan5一成软骨能力的变化。CACTGTTACCGCCACTTCCC一3．5一1资料与方法GACATCGTTCCACTCGCCCT一3；GAPDH：senses5一1．1MSCs细胞培养和成软骨诱导TGGAAATCCCATCACCATCT一3，anri—senses仁1．1．1细胞的分离和培养麻醉新西兰大白兔(复旦大学附属GTTCATGCCCATCACAAACA一3，引物由上海申能博采公司中山医院动物室提供)后，经股骨粗隆转子间窝处穿刺抽取骨髓5

7、mL合成。反应产物行1．5％琼脂糖凝胶电泳，对凝胶进行DNA光密(2×l0V／L、肝素抗凝)，转入预装有DMEM(PAA)离心管中，室温度扫描；显色条带经图像分析系统(AlphaImager2000)检测其积分光密l000r／min离心5min，去除脂肪和上清；DMEM重悬、洗涤细胞，度1019值，与内参的比值为mRNA表达水平参数。同样条件下离心、弃上清液；l0％胎牛血清(FCS)一DMEM重悬细胞，l。3统计学处理所有数据用Sl2．0统计软件进行分析。各组接种于培养瓶中，加完全培养液(10％FCS、青霉素Gl0U／L

8、，链霉数据均采用均数±标准差表示，各代MSCs两两之间比较用LSD素100mg／L的低糖DMEM培养基，37~C、5％CO，培养箱中培养，(Least—SignifieantDiferenee)分析。24h后轻轻倾斜培养瓶更换部分培养液；3d后，更换全部培养液，去除2结果未贴壁细胞，此后每3天换液1次。2．1免疫组化