13—取代小檗碱衍生物合成和其抗肿瘤活性探究

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1、13—取代小檗碱衍生物合成和其抗肿瘤活性探究　　[摘要]目的通过在小檗碱的13位上引入不同取代基，探讨13-取代小檗碱衍生物的体外抗肿瘤活性构效关系，并对其抗肿瘤作用机制开展初步研究。方法以小檗碱为起始原料，13-烷基小檗碱（3a-3j）可经选择性还原后与脂肪醛反应而制备；13-取代苄基小檗碱（3k-3n）可经碱性条件下丙酮加成后与取代溴苄反应而制备。采用磺酰罗丹明B（SRB）法和流式细胞仪分别检测化合物的肿瘤细胞活性及周期的影响。结果设计合成了14个目标化合物，其中7个为全新化合物，其结构经1H-NMR和高分辨质谱确证。所有目标物的抗肿瘤活性均强于小檗碱，其中3h对人肝癌Hep

2、G2细胞和白血病细胞HL60的IC50分别达到了0.08μg/mL和0.06μg/mL。初步构效关系研究表明：13位烷基取代衍生物活性明显优于13位苄基取代衍生物；13位烷基链长度适中时活性最好。初步作用机制显示：3h可将肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期，使细胞增殖受阻，达到抗肿瘤效果。结论13-取代小檗碱具有发展成为一类新型抗肿瘤药物的潜力。[关键词]13-取代小檗碱；抗肿瘤；构效关系；白血病[中图分类号]R730.52[文献标识码]A[文章编号]81673-7210（2013）06（c）-0017-04小檗碱又称黄连素，是从毛茛科植物黄连、芸香科植物黄柏等提取的一种异喹啉类生物碱

3、[1-2]，有多种药理作用，临床主要用于清热、解毒、抗肠道细菌抗感染以及糖尿病的治疗[3-6]。近年研究发现小檗碱还有抗肿瘤作用，即对多种肿瘤细胞具有抗增殖作用[7-9]。本课题组在开展小檗碱（化合物1，图1）衍生物多种生物活性的研究中，发现13-辛基小檗碱（3f，图1）具有显著的细胞毒活性，体外结果表明对人肝癌细胞HepG2的IC50值达到0.37μg/mL，对实体肿瘤显示出良好的潜在药效。基于小檗碱13位辛基取代以后抗肿瘤活性明显提高的结果，本研究以3f为先导化合物，将小檗碱13位辛基用长短不一、大小不同的取代基替换，此探讨此类化合物13位取代基对抗肿瘤活性的影响，以期寻找到

4、全新结构骨架、治疗指数高的抗肿瘤候选物。共设计合成了14个类似物，结构均经1HNMR以及HR-ESI-MS分析确证，其中7个为全新结构的化合物。8采用小檗碱（1）为原料，经NaBH4选择性还原，生成二氢小檗碱（2），再与脂肪醛反应，经盐酸酸化，得到相应的13-烷基小檗碱（3a～3j）[10-11]。13-取代苄基小檗碱（3k～3n）同样以小檗碱（1）为原料，与丙酮反应生成丙酮小檗碱（4），再经溴苄取代得到[12]。合成方法见合成路线图2。1材料与方法1.1仪器与试剂熔点用CXM-300熔点仪测定，温度未校正；1HNMR用BrukerAVANCEIII400核磁共振仪测定，TMS为

5、内标；HR-MS用JEOLAccuTOFCS质谱仪测定；化合物纯化使用CombiflashRf200快速柱色谱；荧光检测用上海顾村仪器厂的三用紫外分析仪，一般薄层层析（TLC）采用E-Merck公司预铺硅胶铝箔卷。试剂均为分析纯。1.2化学合成方法1.3生物活性评价1.3.1化合物IC50测定方法在96孔板上孔接种不同的肿瘤细胞，24h后采用不同浓度的化合物进行增殖抑制实验，实验参考文献[13-14]。48h后，细胞用50%三氯乙酸（TCA）固定，并用SRB（0.4%）稀醋酸溶液染色。室温静置10min，未与细胞结合的SRB用1%稀醋酸溶液洗5遍，空气干燥。结合的SRB用10mm

6、ol/L非缓冲Tris碱液（pH10.5）振荡溶解，酶标仪测定各孔光吸收，测定波长为492nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖的抑制率。计算公式为抑制率（%）=（1-化合物OD492/对照OD492）×100。然后采用Sigmaplot计算化合物的IC50。1.3.2流式细胞仪测定方法用1.88μg/mL的化合物3h处理HCT116细胞，分别在4、8、12h和24h收集药物处理后的细胞，实验参考文献[15-16]。PBS洗2次，加入预冷的75%乙醇，-20℃固定过夜，离心除去乙醇，PBS洗两次，加入200μg/mLRNA酶，37℃消化30min，加碘化吡啶25μg/mL，4℃避

7、光染色30min后，流式细胞仪检测细胞周期变化。2结果2.1目标化合物3a-3n的体外抗细胞增殖活性采用磺酰罗丹明B染色法（SRB），选择HepG2细胞作为初筛模型，以羟基喜树碱（HCPT）为阳性对照，对所合成的14个衍生物进行体外抗肿瘤活性评价，结果见表1。初步构效关系分析表明：①13-烷基化合物3a-3j具有较好的体外抗肿瘤活性，尤其是烷基链长度适中时最好，化合物3d和3h对HepG2细胞的IC50值达到0.08μg/mL；②13-取代苄基化合物3k-3n体外抗肿瘤活性明显低