EBER检测试剂盒(原位杂交).pdf

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1、EBER检测试剂盒（原位杂交）（操作之前请详细阅读此说明书）检测原理和意义EBER是EB病毒编码的小RNA，是EB病毒的表达产物，在EB病毒感染的细胞核中以高拷贝数存在。根据EBER的特有序列设计的EBER单链DNA探针能特异地与EBER靶序列互补、杂交，从而检测EB病毒是否存在。此方法检测石蜡组织切片中的EB病毒具有极高的特异性和灵敏性。目前EBER原位杂交已成为组织和细胞中EB病毒的标准检测方法，在国际上广为使用。试剂盒提供的材料和试剂提供量成份保存方法20人份50人份1EBER杂交液-20℃400ul1.0ml2蛋白酶K4℃40ul100ul3一抗4℃1ml2.5

2、ml4二抗4℃1ml2.5ml5HRP聚合物4℃1ml2.5ml6DAB底物4℃1ml2.5ml7DAB4℃20ul50ul818X18mm盖玻片4℃/室温20片50片9湿盒增效液4℃/室温30ml30ml（注意：EBER杂交液请-20℃保存）用户自备材料和试剂1.55℃恒温培养箱8.二甲苯2.37℃恒温培养箱9.酒精3.光学显微镜10.PBS(pH=7.6)4.移液器11.苏木素5.计时器12.氨水6.玻片染色缸和染色架13.盐酸酒精7.湿盒2个实验前需配试剂30％湿盒增效液取湿盒增效液及蒸馏水，按3:7配制成30%湿盒增效液备用。实验时需配试剂A、1X蛋白酶K将蛋白

3、酶K与1×PBS按1：25的比例配制备用。（现配现用）B、DAB显色液依据需要配制DAB显色液，以可覆盖整个组织的量为宜。取DAB与DAB底物，按照1：50的比例混匀，避光保存备用。(现配现用)操作步骤1．切片处理：将4um厚度的组织粘附在APES处理的载玻片上，切片于60-70℃烘烤60分钟以上。（建议每次实验同时附加阳性、阴性对照片）2．脱蜡及水化：溶液次数×时间（分）二甲苯3×10100%酒精1×395％酒精1x380%酒精1×3蒸馏水1x3（注意：使用过的二甲苯，应相应延长脱蜡时间，以保证脱蜡完全）3．蛋白酶K消化：甩干切片,将组织周围液体用滤纸吸干,每张切片滴

4、加适量1×蛋白酶K工作液(约50ul，根据组织大小增、减量),室温孵育5分钟。蒸馏水洗涤1×1分钟，小心擦干组织周围液体。4．杂交：4.1每张切片滴加适量杂交液(约20ul，根据组织大小增、减量)，并加盖玻片（本试剂盒配备，可根据加入杂交液量进行剪裁）；4.2放置水湿盒中，55℃恒温箱孵育60-90分钟；4.3转至37℃孵育4-16小时（放置于30%湿盒增效液湿盒中）。建议过夜（＜16小时）以保证低拷贝样本的杂交效果；4.448℃（PBS预温）浸泡切片，小心移去盖玻片，继续浸泡5分钟；4.548℃PBS洗涤3x5分钟(轻微振荡容器)；（注意：盖玻片规格应与杂交液量匹配，

5、切片在整个试验过程中要保持湿润状态，防止干片）5．信号放大与显色：5.1小心擦去组织周围液体，滴加适量一抗(约50ul，根据组织大小增、减量)，37℃，水湿盒中孵育30分钟；37℃PBS浸泡3x2分钟（轻微振荡容器）；5.2小心擦去组织周围液体，滴加适量二抗(约50ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育20分钟；室温PBS浸泡3x2分钟(轻微振荡容器)；5.3小心擦去组织周围液体，滴加适量HRP聚合物(约50ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育30分钟；室温PBS浸泡3x2分钟(轻微振荡容器)。5.4小心擦去组织周围液体，滴加适量DAB显色液(约5

6、0ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育约10分钟（不同样本的显色时间可能有所差别，建议镜下观察显色过程）；室温PBS浸泡3x2分钟(轻微振荡容器)。5.5自来水冲洗，苏木精复染（可用盐酸酒精分化及氨水返蓝）。梯度酒精脱水，中性树胶封片。阳性结果判断标准：仅为细胞核着色。胞浆和胞膜着色不能视为阳性，只有当核分裂时可以出现胞浆阳性着色。其他事项：本试剂保质期为12个月。客户在收到产品时请及时检查，如发现有外包装破损、试剂盒成分不全等产品问题，或者在使用过程中有任何疑问，请及时与泰普客户服务中心联系，我们将及时为您解决。公司信息：公司名称：福建泰普生物科学有限公司

7、总部：福建省福州市金山金洲北路7号金山科技企业孵化器7号楼4层邮编：350002电话：800-804-8333，0591-28053600传真：0591-28053700研发中心：北京市昌平区北清路中关村生命科学园创新大厦A座207室邮编：102206电话：010-80720071传真：010-80720072操作步骤简表操作参数1二甲苯3X10’2100%酒精1X3’395%酒精1X3’480%酒精1X3’5蒸馏水1X3’6酶消化室温,5’7蒸馏水1’8加杂交液适量955℃变性60’-90’1030％湿盒增效液的湿盒中孵育37℃，4-1