OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法.pdf

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1、OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击：194次相关专题?MEM细胞培养基无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE2000说明书上列举

2、了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。2、溶液1：240ul无血清培养基+10ullipofectamine2000perwell(总体积250ul)(温育5min)3、溶液2：Xul无血清培养基+4ug质粒perwell(总体积250ul)4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基

3、冲洗细胞两遍后，加入2ml无血清培养基。6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。1.细胞的状态。这点非常重要

4、，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高)。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，

5、细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训!5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。6.48小时mRNA表达最高;72h蛋白表达最高。加转染试剂(Opti-MEMI),细胞就浮起或死亡问题分析?各位前辈：我想把microRNA转到成纤维细胞内，用的是GIBCO(tm)Opti-MEMIReduced-SerumMedium(1X)和Lipofectamine?2000转的。现在的问题是一加转染试剂细胞就

6、大量死亡。Opti-MEM和冲洗用的PBS都37度预热过的。甚至我用无血清的DMEM对照也大量死亡。有时细胞死亡稍微好点，是不是和细胞批次关系更密切，还是有其他原因。我的实验操作：110%血清DMEM接种细胞在24孔板，长至30~50%满底时进行转染。2lipofectamine20000.5ul稀释于25ulOpti-MEMIReduced-SerumMedium(1X)(GIBCO)静置5分钟3microRNA10pM稀释于25ulOpti-MEM4混匀2和3，加Opti-MEM至500ul。室温静置30min。5用PBS(室温)轻轻冲洗培养空，镜下观察部分细胞

7、略变圆(或有变圆倾向)，但没什么细胞浮起。吸去PBS，轻轻加入2和3的混合物。镜下观察，即刻细胞大量浮起，或细胞挛缩，有细胞死亡倾向。6h后证实细胞大量死亡。但有细胞干死在培养皿底的印迹。不同批次的细胞，死亡情况略有不同。问题分析：1.不是说明书上说什么你就做什么，你是有自主意识的。2.你的细胞加opti-MEM就不好有两种可能：a。你养的细胞有问题，或者有共生菌，改变培养条件就可能爆发;b。你的细胞对opti-MEM敏感。为什么一定要用opti?你没有自己的主见吗?3.你的转染有问题。从你的描述来看，你并不是接种后24hr左右立即做转染，而是让它长到50%左右