OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法.pdf

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1、OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期:2012-05-17来源:互联网作者:青岚点击:194次相关专题?MEM细胞培养基无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质,本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料,步骤、个人经验以及问题分析。贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE2000说明书上列举

2、了24孔、12孔、6孔......板的实验体系,因为需要转染的细胞量大,所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天,以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时,细胞要达到90~95%的融合。2、溶液1:240ul无血清培养基+10ullipofectamine2000perwell(总体积250ul)(温育5min)3、溶液2:Xul无血清培养基+4ug质粒perwell(总体积250ul)4、将溶液1与溶液2混合,室温下置20min。5、与此同时,将6孔板中的细胞用无血清培养基

3、冲洗细胞两遍后,加入2ml无血清培养基。6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中,摇动培养板,轻轻混匀。在37℃,5%的CO2中保温5~6小时。7、6小时后,更换含有血清的全培养基,在37℃,5%的CO2中48~72h检测转染水平。8、如果做稳定转染,换全培养基培养后24h,即可以1:10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板,加抗生素进行筛选。三、个人经验:我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的,有了经验之后,现在做转染得心应手,转染前后细胞的形态几乎不发生变化,几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验,与大家分享。1.细胞的状态。这点非常重要

4、,不要急于求成,一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做,那时细胞状态最好,不要用传了很多代的细胞去做,细胞的形态都会发生变化了。2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做,细胞太少,容易死的。3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用,有条件的话,就用它代替PBS洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM,前者的转染效率确实高)。注意洗的时候要轻,靠边缘缓缓加入液体,然后不要吹吸细胞,而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害,细胞又损失一部分,加了脂质体后,

5、细胞受影响就更大了,死亡细胞会增多。4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长,对细胞是有毒性的,这里有血的教训!5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒,我做的结果都不好。6.48小时mRNA表达最高;72h蛋白表达最高。加转染试剂(Opti-MEMI),细胞就浮起或死亡问题分析?各位前辈:我想把microRNA转到成纤维细胞内,用的是GIBCO(tm)Opti-MEMIReduced-SerumMedium(1X)和Lipofectamine?2000转的。现在的问题是一加转染试剂细胞就

6、大量死亡。Opti-MEM和冲洗用的PBS都37度预热过的。甚至我用无血清的DMEM对照也大量死亡。有时细胞死亡稍微好点,是不是和细胞批次关系更密切,还是有其他原因。我的实验操作:110%血清DMEM接种细胞在24孔板,长至30~50%满底时进行转染。2lipofectamine20000.5ul稀释于25ulOpti-MEMIReduced-SerumMedium(1X)(GIBCO)静置5分钟3microRNA10pM稀释于25ulOpti-MEM4混匀2和3,加Opti-MEM至500ul。室温静置30min。5用PBS(室温)轻轻冲洗培养空,镜下观察部分细胞

7、略变圆(或有变圆倾向),但没什么细胞浮起。吸去PBS,轻轻加入2和3的混合物。镜下观察,即刻细胞大量浮起,或细胞挛缩,有细胞死亡倾向。6h后证实细胞大量死亡。但有细胞干死在培养皿底的印迹。不同批次的细胞,死亡情况略有不同。问题分析:1.不是说明书上说什么你就做什么,你是有自主意识的。2.你的细胞加opti-MEM就不好有两种可能:a。你养的细胞有问题,或者有共生菌,改变培养条件就可能爆发;b。你的细胞对opti-MEM敏感。为什么一定要用opti?你没有自己的主见吗?3.你的转染有问题。从你的描述来看,你并不是接种后24hr左右立即做转染,而是让它长到50%左右

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