基因诊断(1)教程文件.ppt

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1、基因诊断(1)传统的诊断１、问、望、听、触…—经验型判断的方法。２、化验/检验——细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物；微生物、免疫学、生物化学、病理学等。３、影像学—X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。４、特殊检查—染色体检查、肌电/脑电/心电、骨密度、原子吸收光谱等。随着技术水平的发展，这些诊断方法也在不断的提高和完善，在医学实践中发挥了巨大的作用。并还将有更先进的方法问世。但这些方法大多存在一个无法克服的缺陷：不可预先诊断。随着分子生物学和分子遗传学的发展，越来越多的证据表明，绝大多数疾病的发生和发展都与患者的遗传物质结构和功能改变有关，所以遗传物质

2、的检查越来越显得必要。基因诊断的定义应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构和功能变化而作出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断。基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是遗传性疾病做出预先诊断的优点。它是一种极具发展潜力的诊断方法。由于基因诊断发展的时间不长，人们对于基因，特别是致病基因的了解还有许多空白，因此许多疾病的诊断还主要依靠其他方法。此外，基因诊断的发展并非取代和抛弃其他方法，而是相互补充，共同发展。长期以来，单基因遗传病的诊断主要靠临床观察和一系列生化检查，但生化学检查要求有相应基因表达产物的体液或细胞，并对基因产物或代谢异常

3、机理有所了解。但对绝大多数遗传病而言，目前还远未达到这种认识。。理想的诊断方法是对患者基因或DNA本身直接进行分析，因为这种分析摆脱了上述各种限制。机体各种组织的核细胞均有全套基因组DNA，可以作为分析的材料，而不必考虑表达问题，是目前诊断技术中最具发展前途的技术。诊断方法的变更基因诊断的对象1.病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原体、细菌、寄生虫。2.先天遗传性疾患，如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症。3.后天基因突变引起的疾病，如肿瘤。4.其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证。与疾病相关的遗传物质改变主要有两类，1.遗传物质，即DNA或RNA的水平的变化。如病

4、毒感染时病毒基因及其转录产物在人体内的从无到有，某些肿瘤中癌基因表达水平的从低到高。2.遗传物质的结构变化，即基因突变。如点突变引起的基因失活、染色体转位引起的基因激活或灭活等等。因此，从理论上说，所有涉及基因结构和功能变化的检测都属于基因诊断。基因诊断的内容常用基因诊断的技术1.Hybridization2.PCR3.RFLP4.AFLP5.ASO6.SSCP每个人的DNA是不完全相同的，一般每100－500bp就有一个是不相同的，即多态性。在两套基因组DNA中平均有1000万处不同，它们多位于内含子序列中。碱基的变异就可能导致酶切点的消失或新的切点出现，当

5、使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）。RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法检出。1.RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)等位基因2由于出现新的切点，DNA片段缩至8kb。DNA片段电泳后杂交图RFLP的检出等位基因1因有额外切点而导致产生两个长

6、短不同的DNA片段（3kb及5kb）且均能与探针杂交。在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫星DNA。它们分布十分广泛，每个重复单位通常只有几－－几十个碱基对，但其重复次数在人群中是高度变异的，又叫数目变异的串联重复（variablenumbertandemrepeats,VNTR）。当用限制酶切割VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各种长度不同的片段，可用于致病基因的连锁分析。串联重复的短片段的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（AFLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物

7、即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析。2.AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism）当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specificoligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定

8、杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这