内毒素凝胶法检查技术PPT课件.ppt

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1、凝胶法BET检查技术湛江安度斯生物有限公司2009年3月.1、凝胶法BET试验程序2、试验器具3、鲎试剂灵敏度复核4、干扰初筛试验5、干扰试验6、检查法7、实验相关知识及技巧2021/7/282.1、凝胶法BET的实验程序试验准备确定供试品的内毒素限值选择鲎试剂计算最大有效稀释倍数或最低有效浓度鲎试剂灵敏度复核干扰初筛试验干扰试验日常检查2021/7/283.2、试验器具试验器具的要求及处理玻璃器皿需经除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后在>250℃至少干烤1小时

2、塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具2021/7/284.孵育反应仪器恒温水浴箱干式恒温仪2021/7/285.孵育反应温度是鲎试验的重要条件参数之一现行法规对反应温度的要求较宽松(37±1℃)严格的实验条件是实验室水平的重要标志之一80年代发达国家已使用干式恒温仪取代水浴箱2000年版《中国药典》BET法开始接受干式恒温仪TAL-40型试管恒温仪的特点温控精确：37±0.2℃发热均匀：<0.1℃可定时及提示：0~90分钟任意可设定时，

3、到时蜂鸣提示试管免封口，无水蒸气或水滴影响体积小巧，使用方便2021/7/286.3、鲎试剂标示灵敏度的复核试验实验目的验证实验室的条件是否满足BET实验的要求验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等）是否满足BET实验的要求2021/7/287.实验步骤开启恒温仪器预热C溶液(标准内毒素溶液)的制备鲎试剂的准备加样及恒温反应结果判断数据处理2021/7/288.操作步骤示意图稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液(C溶液)

4、0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管NC：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管单次管：原安瓿多次管：反应试管轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合30秒旋涡混合器混合15min混匀混匀BET水复溶BET水复溶内毒素RSE或CSE鲎试剂TAL37℃±1℃，孵育60min±2min混匀（水浴恒温需封口）翻转180度，观察凝胶状况2021/7/289.灵敏度复核试验举例试剂试剂名称厂家规格标示效价数量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml18内毒素标准品(CSE)安

5、度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水(W)安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml12021/7/2810.1）标准内毒素溶液C的制备0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s30s2.0ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml2.0ml3.6ml2.0ml2.0ml0.125EU/ml30s2.0ml2.0ml0.06EU/ml30s2.0ml2.0ml混合5分钟2021/7/2811.2）鲎试剂的准备取0.1ml装量，

6、灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两支，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列：用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解阴性对照溶液D0.06EU/ml0.125EU/ml0.25EU/ml0.5EU/ml2021/7/2812.3）加样用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液C，加入复溶的鲎试剂中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET水（

7、D溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照CSETAL0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.1ml0.06EU/ml0.1ml0.1mlBET水0.1ml加样顺序一般从低浓度到高浓度2021/7/2813.4）恒温反应将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污

8、染2021/7/2814.5）结果判断将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180℃，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“＋”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“-”。＋＋＋＋－－－－阳性阴性结果判断：反应管缓缓倒转180º阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者试验符合要求的基本条件：NC管全部阴性（－－）2λ管全部阳性（＋＋＋＋）0.25λ管全部阴性（－－－－）2021/7/2815.6）数据处理