《细菌内毒素检查》PPT课件

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1、细菌内毒素检查2010.12目录1、实验原理2、实验试剂3、试验器具4、检查方法概述5、供试品溶液的制备6、内毒素限值的确定7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定8、鲎试剂灵敏度复核9、干扰试验10、供试品的细菌内毒素检查实验原理利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。阳性结果细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。实验试剂鲎试剂从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏

2、度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。实验试剂细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。试验器具刻度吸管、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试

3、管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热原的一次性用品）。检查方法概述凝胶法限量试验半定量试验光度测定法浊度法（终点浊度法和动态浊度法）显色基质法（终点显色法和动态显色法）凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法对干扰相对不敏感。较光度测定法不灵敏供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8

4、.0的范围内。可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。内毒素限值的确定一般按公式：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示。K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）。M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，依据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。例：某产品M为14.3mg/kg，L=5/14.3=0.35EU/mg假如此产品的浓度为100mg/ml，那么，L=0

5、.35100=35EU/ml最大有效稀释倍数的确定最大有效稀释倍数（MVD）指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVD=cL/λ式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。鲎试剂灵敏度复核目的考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察

6、检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。细菌内毒素标准溶液的准备1、取细菌内毒素工作标准品（或国家标准品）一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。鲎试剂灵敏度复核2、按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ和0.25λ（λ为所复核

7、的鲎试剂的标示灵敏度）四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。示例某待复核鲎试剂的灵敏度标示值为0.25EU/ml，细菌内毒素工作标准品规格为150EU/ml，将细菌内毒素工作标准品用1ml细菌内毒素检查用水溶解，再稀释制备成浓度为0.50EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml和0.06EU/ml的细菌内毒素标准溶液。鲎试剂灵敏度复核细菌内毒素标准溶液的制备图示：鲎试剂灵敏度复核待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，每支加入0.1ml检查用水使溶解备用（规格大于0.1ml／支的鲎试

8、剂，按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按0.1ml/管分装到凝聚管中，至少准备18管）。加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支，1列2