细菌内毒素检查

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1、细菌内毒索检杳1、实验原理2、实验试剂3、试验器具4、检杏方法概述5、供试品溶液的制备6、内毒素限值的确定7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定8、懸试剂灵敏度复核9、干扰试验10、供试品的细菌内毒素检查1、实验原理：利用蛍试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内-毒索的量川内毒索单位（EU）表示°2、实验试剂：①蠻试剂：从海洋无脊椎动物“餐”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制的生物制剂。當试剂的牛物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即卷试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的卷试剂或试验

2、条件发生对能影响检验结果的改变时，应进行當试剂灵敏度复核试验。②细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒索，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁蛍试剂灵敏度。③细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中卷试剂灵嫩度复核、干扰试验及各种阳性对照。④细菌内毒素检查用水：指内毒素含量少于（）.（）15EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒索试验无干扰作用的灭菌注射用水。3、实验器具：刻度吸管、凝聚管（10X75mn））、三角瓶、小试管（lOXlOOmm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、

3、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。耐热器皿常用干热灭菌法（250°C,30分钟以上）去除，塑料川具应选川无内毒索并且对试验无干扰的器械（目前多为无热源的一次性用品）。4、检验方法概述①凝胶法：限量法、半限量法②光度测定法：浊度法（终点浊度法和动态浊度法）、显色基质法（终点浊度法和动态浊度法）凝胶法：最简单、经汛应用广泛、中国药典的“仲裁”方法，对T扰相对不敏感，较光度测定法不灵敏。5、供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0〜&0的范围内。可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。6、内毒素限值的确定一般按公式：L

4、=K/M式中：L为供试品的细菌内毒素限量,以EU/ml,EU/mg、或EU/U（活性单位）表示。K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒索剂量，注射剂K=5EU（kg.h），放射性药品注射剂K=2.5EU（kg.h）靶内用注射剂K=0.2EU（kg.h）。M为人人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，依据药品使用说明书，W临床用药须知2规定。7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定最大有效稀释倍数（MVD）指在试验小供试品溶液被稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限度的测定。MVD=C1/X式中：L为供试品的细菌内毒素限量，C为供试殆溶液的浓度，当L以EU/ml表示时

5、，则C等于1.0ml/ml,当L以EU/mg表示时,C的单位为mg/ml,入为在凝胶法中蛍试剂的标示灵敏度（EU/ml）。8、蛍试剂灵敏度复核目的：考察蛍试剂的灵敏度是否符合标准，考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。当使用新批号的餐试剂或试验条件发生可能影响检查结果的改变时，应进行卷试剂灵敏度复核试验。细菌内毒素标准溶液的准备：①、収细菌内毒素工作标准胡（或国家标准品）—•支,轻弹瓶壁，使粉末洛入瓶底，然后用砂伦在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后川开，启开过程屮应防止玻璃屑落入瓶内。②、按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检杳用水溶解其内容物，用封口

6、膜将瓶口封严，置旋涡混介器上混介15分钟，然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2入、X.0.5X和0.25入（X为所复核的當试剂的标示灵敏度），四个浓度的内毒素标准溶液，毎稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30分钟。示例：某待复核蛍试剂的灵敏度标示值为O.25EU/ml,细菌内毒素工作标准品规格为150EU/ml,将细菌内毒素工作标准品用1ml细菌内毒素检查用水，再稀释制备成浓度为0.50EU/ml,0.25EU/ml,0.125EU/ml和0.06EU/ml的细菌内毒素标准溶液。细菌内毒素标准溶液的制备过程图示:0.5mI1.95ml15OEUmI15EU/mI

7、2.OEU/mI0.5EU/mIJ

8、0・6mI0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml待复核蛍试剂的准备取规格0.1ml/支的蛍试剂18支，每支加入0.1ml检验用水使溶解备脉规格人于0.1ml/支的卷试剂，按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按0.1ml/管分装到凝聚管中，至少准备18管）。加样将已充分溶解的待复核卷试剂18支（管）放在试管架上，排成5歹U，其中4列4支，1列2支。其中4支4列分别加入0.1ml的2入、入、0.5X和0.25入内毒素标准溶液，另2支（管）加入0.lml