兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验ppt课件.ppt

《兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验XXX实验目的1.学习如何设计实验，训练学生独立设计并完成实验的能力。2.通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能，从牛血清中分离提取白蛋白，并鉴定。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质,约占总量的60%，牛血清白蛋白分子量约66.2kDa。它是一种水溶性很强的蛋白,结构稳定,能结合多种小分子,如脂肪酸,胆红素,血红素等,起维持血液的正常渗透压作用.白蛋白分离纯化的意义①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构

2、与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。④基因工程的需要分离纯化的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的

3、生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。分离纯化的一般程序选择材料破碎细胞提取分离纯化分析及鉴定（盐析，离子交换色谱）（电泳）（离心）1.粗提盐析原理:<1>不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。<2>影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。操作:<1>取0.5ml血清<2>取0.5ml饱和(NH４)２SO４溶液，缓慢滴入，边加边摇。<3>混匀后于室温中放置10分钟。<4>8000r/min×10min<5>小心吸取上清液备用

4、，初步获得白蛋白。操作2.脱盐盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分，样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。透析原理：通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保

5、留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。操作：新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间。在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。放入盛有蒸馏水的大烧杯中，磁子搅拌，于4℃透析过夜,按时更换透析液。检查透析效果：1％BaCl2检查(NH4)2SO43

6、.纯化离子交换色谱是蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。原理：离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带有相反电荷的离子结合。当流动相中存在其他相反电荷的离子时，就与结合在固定相交换基团上的反离子进行交换。得到纯化的白蛋白++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-0.02MNH4AC++++++蛋白样品---------++++++AC-AC-AC-AC-AC

7、-AC-NH4+0.06-0.3MNH4AC--白蛋白，α、β球蛋白带负电阴离子交换剂三、纯化（阴离子交换层析）洗脱将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/LNH4Ac洗脱30ml。（去掉α、β-球蛋白）改用0.3mol/LNH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（纯化的白蛋白）再生：0.3mol/LNH4Ac20ml，0.02mol/LNH4Ac40ml原理：蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH

8、有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。白蛋白等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到白蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。四、醋酸纤