三血清醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

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1、血浆蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳实验目的1、掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血浆蛋白质的实验操作技术和注意事项。3、了解醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳的优点及使用范围。醋酸纤维素薄膜电泳采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120μm，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。醋酸纤维素薄膜电泳的优点及应用具有微量、快速、简便、区带清

2、晰、灵敏度高、便于摄影和保存等优点。用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。原理血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白，纤维蛋白原６条区带。血浆蛋白质的等电点、平均相对分子量、及正常含量球蛋白清蛋白Aα1α2βγpI相对分子量（×104）含

3、量（%）4.886.957~725.06202~55.06304~95.129~156.2~126.85~7.315.6~3012~20实验材料健康人血浆或动物血浆试剂1、pH8.6巴比妥缓冲液2、氨基黑10B染色液3、漂洗液4、洗脱液5、透明液（试剂配制参见实验讲义）定量时用仪器和器材1、常压电泳仪、电泳槽2、醋酸纤维素薄膜（2×8cm）3、点样器（载玻片或盖玻片）、玻璃板4、培养皿（泡膜、染色和漂洗用）5、滤纸6、镊子7、试管、试管架、吸量管8、分光光度计（定量用）操作步骤1、薄膜准备①将醋酸纤维素薄膜切成2×8cm的小条。②在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线。

4、③在薄膜角上用铅笔作一标记。④将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中20min。操作步骤醋酸纤维素薄膜规格及点样位置8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）操作步骤2、电泳仪准备在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。操作步骤3、点样（电泳的关键步骤）用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在玻璃板上（粗面朝上），将点

5、样器先在培养皿的血浆中沾一下，再在膜条点样线处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血浆样品。点样线尽量点得细窄而均匀。宁少勿多。操作步骤4、上槽待血浆吸入膜后，以薄膜粗面向下、点样端置阴极端，两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平，加盖，平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。切勿使点样处与电泳槽接触醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图操作步骤5、电泳检查电泳装置是否正确，开启电源，调节电压、电流，然后通电40~60min。电压：110~130V（10V/cm膜长）薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和。电流：0.4~0.6mA/cm膜宽有数条膜

6、便求数条膜宽的总和。操作步骤6、染色和漂洗电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2~3次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。操作步骤血浆蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱－＋电泳方向Aα1βγα2纤维蛋白原操作步骤7、透明薄膜完全干燥后，浸入透明液中20min后，取出平贴在玻璃板上（不要留有气泡），完全干燥后即成透明的薄膜图谱，要作扫描或照相用。可长期保存。操作步骤8、定量（略）①洗脱比色法②光密度计扫描法应用实例血清蛋白电泳光密度扫描同工酶：催化相同化学反应，而蛋白质分子结构不同的一组酶。乳酸脱氢

7、酶M骨骼型H心肌型HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)乳酸脱氢酶同功酶电泳*生理及临床意义同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断。心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱2345血红蛋白的结构α亚基β亚基血红蛋白地中海贫血：由于α和β珠蛋白肽链合成异常而导致其比例不均衡引起的溶血性贫血。正常人Hb区带：从负极向正极泳速最快的HbA，占大部分，约95%；HbA后有一较浅区带为HbA2