血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

《血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳【原理】由于不同的蛋白分子在同一环境中解离情况不同、分子大小不同等差异，电泳时可将其分离。醋酸纤维素薄膜电泳具有分离速度快，区带清晰，操作简便等优点。血清含多种蛋白质，用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，经固定染色后不仅可看到清晰的色带，而且可定量测定，计算出各种蛋白质的百分含量，其正常值如下：A(白蛋白)57～72%α1球蛋白2～5%α2球蛋白4～9%β球蛋白6.5～12%γ球蛋白10～20%某些肝、肾疾病上述蛋白含量发生改变。【仪器】电泳仪721型分光光度计染液盘漂洗盘镊子(或竹夹

2、子)【试剂】1．巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.06)：巴比妥纳12.7g，巴比妥1.66g，先加水少量，小心加热溶解，最后用蒸馏水定容为1000ml，4℃保存。2．氨基黑10B染色液：氨基黑10B0.5g，甲醇50ml，冰醋酸1.0ml，蒸馏水40ml，混匀。3．漂洗液：95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，按比例混匀。4．0.4NNaOH溶液。【操作】1.点样：将醋酸纤维薄膜切成8cm×2cm条状，浸于巴比妥缓冲液，待完全浸透后，取出置于滤纸上，轻轻吸去多余的缓冲液，再于薄膜的无光泽面的一端2.

3、5cm处，用小玻片蘸取少许血清，垂直印于膜上，待样品浸入膜后，将薄膜有样品的一面向下(以防蒸发干)贴在电泳槽架上，两端用数层浸湿的滤纸（或纱布）作盐桥贴紧。（其他样品同样处理，若需标记，只能用铅笔书写于有光泽面的两端。）2．通电：一般电压用90～120V，电流约0.4～0.6mA／cm，通电45至60分钟，待电泳区带展开约25～35mm后关闭电源。3．染色：通电完毕，将薄膜直接浸于染色液中，3～5分钟后取出放入另一盘中，用漂洗液浸洗数次,每次3分钟，至脱色使背景无色为止。染色完毕，将染色液倒回原瓶，漂洗液注入回收瓶。

4、4．定量：将漂洗完毕的薄膜吸干，剪下每种蛋白质色带，另于空白处剪一窄条薄膜，分别放入有4m10.4NNaOH的中试管内，振摇数次，使染料色泽浸出，30分钟后，分别于650nm处读吸光度(空白薄膜条浸出液作空白对照)。【计算】吸光度总和T为各种蛋白吸光度的总和：T＝A+α1+α2+β+γ。分别计算每种蛋白的百分数A白蛋白（%）=×100%Tα1α1球蛋白（%）=×100%Tα2α2球蛋白（%）=×100%Tββ球蛋白（%）=×100%Tγγ球蛋白（%）=×100%T现在许多实验室采用光密度计定量法：待薄膜完全干燥后，浸

5、于透明液中约5～10分钟，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后成为透明的膜。然后在光密度计上测定吸光密度，并可绘制成曲线，或者直接计算出各种蛋白质的百分含量。实验五影响酶活性的因素【目的和要求】1.巩固温度、pH值、激活剂、抑制剂对酶活性影响的认识。2.学习测定酶的最适温度、最适pH值的简单方法，学习检测激活剂和抑制剂的方法。本实验分为三个小实验。一、温度对酶活性的影响【原理】温度对酶的活性有显著影响。温度降低，酶促反应减弱或停止，温度升高，反应速度加快，当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值，此温度称为酶的最适温度。温

6、度继续升高，反应速度反而迅速下降。人体内大多数酶的最适温度在37℃左右。体外实验，酶的最适温度随反应时间而异，温度愈高，酶蛋白变性愈严重，到80℃时，酶活性几乎完全丧失。以唾液淀粉酶为例，唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。淀粉溶液属胶体溶液，具有乳样光泽，与碘反应呈蓝色；糊精根据分子大小，与碘反应分别呈蓝、紫、红、无色等不同的颜色。麦芽糖不与碘呈色，但具有自由半缩醛羟基，不具还原性。根据上述性质，可以用碘检查淀粉是否水解及其水解程度，间接判断唾液淀粉酶是否存在及其活性大小。【仪器】公用：冰浴1个×2沸水浴1

7、个×2恒温水浴1个×22ml唾液吸量管1支×4烧杯1只×20个人：中试管6支白磁板1块×24滴管3个×20小漏斗1只×8【试剂】1.1％淀粉液，4℃冰箱存放，不超过一周。2.碘液：称取I21g，KI2g同溶于100ml蒸馏水中，棕色瓶内存放。【操作】1.收集唾液：为清除口内食物残渣，用自来水漱口，然后再含一口自来水3-5分钟，自然流到小烧杯中。此步骤可以两人合作，以下步骤需每人作一份。2.取试管两支，各加小烧杯中唾液2ml，一管加热煮沸5分钟，另一管置冰浴中预冷5分钟，放置备用(即为唾液淀粉酶溶液)。3.另取试管4支

8、，编号，按下表依次操作：管号步骤1234第一步各管分别加1％淀粉溶液20滴第二步0—4℃冰浴保温5分钟37℃水浴保温5分钟第三步预冷唾液10滴预冷唾液10滴唾液10滴煮沸唾液10滴第四步摇匀后0—4℃冰浴保温10分钟摇匀后37℃水浴保温10分钟第五步碘液2滴移入37℃水浴保温10分钟中后再加碘液2滴碘液2滴碘液2滴观察结果【注意事项】1.各人唾