血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.doc

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1、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳一、实验目的   1．掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。   2．定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。二、原理 采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120μm。 醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶

2、的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维薄膜电泳趋向于代替纸电泳。三、操作方法一、仪器和薄膜的准备 1．醋酸纤维素薄膜的润湿的选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不均可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不情、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。 将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液

3、，同时分辨出光泽面和无光泽面。2．制作“滤纸桥”：剪裁尽寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电泳槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。二、点样 在薄膜无光泽的一面点样。点样区距负极端1.5㎝处。点样时，先用血色素吸管将2～3微升的血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内（见图4－1）。注意。应使血清均匀分布在点样区，形成具有一定宽度、精细匀称的直线，切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌

4、握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之三、电泳将已点样的薄膜使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，参照图4－2。平衡10min，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后,通电。打开电源开头，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3mA，通电10～15min后，再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为10V左右，薄膜每厘米宽的电流强度为0.4～0.6mA。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约3.5㎝时，则并闭电源，一般通电时间为60min左右①。电泳时间的长短，应以获得

5、血清各组分的最佳分离效果为标准。因为，使用不同型号电泳仪进行实验，有时所需电泳时间差异较大。另外，电泳时产生大量的热，为了获得重复性强、区带清晰的电泳图谱，应使用冷却装置降温。在炎热的夏季，更为必要。四、染色电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。然后，用漂洗液浸洗，每隔10min左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。五、结果判断一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。六、透明将

6、染色后漂洗干净的薄膜用吹风机吹干，再浸入透明液的甲液中，浸泡2min后立即浸入透明液的乙液中，浸泡1min（要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。大约2～3min内的薄膜完全透明，放置10～15min后，用吹风机将膜吹干。在水笼头下将玻璃板上透明的薄膜润湿后，用单面刀片从膜的一角撬起，并划开一端，再用手捏住撬起的膜轻轻撕下，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。用滤纸吸干，浸入液体石腊中，约３min后取出。再用干净的滤纸吸干，压平，则成为色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，可长期保存不褪色。七、定量未经透明处理的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱

7、可直接用于定量测定。一般采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。１．洗脱法：将电泳图谱的各区带剪下，分别浸入盛有0.4mol氢氧化钠溶液的试管中，清蛋白管加入4ml，其余每管各加２ml，摇匀，放入37℃恒温水浴上浸提30min，每隔10min，充分摇动一次，以便将色泽完全洗脱下来。该溶液颜色较稳定，在室温下24小时内颜色强度无显著变化。然后在620nm波长处比色，测定各管的光密度值为O.DA、O.Dα1、O.Dα２、O.Dβ、O.Dγ。按下列方法计算血清各部分蛋白质所占百分率。（１）先计