血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳LF.ppt

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1、实验四：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义;2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术;3.熟悉电泳仪器的使用和操作。一、实验目的：二、实验原理：（一）电泳(electrophoresis)：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极方向泳动的现象。正极负极带负电粒子带正电粒子电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。（二）电泳法：利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的方法和技术。醋酸纤维薄膜电泳

2、是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。血清中各种蛋白质的等电点在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。（三）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳原理+白蛋白(A)α1α2βγ定量----将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。醋酸纤维素薄膜具有均一的泡沫状结构（厚约120m），渗透性强，对分子移动的阻力很弱。用其作支持物进行电泳

3、，具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品无吸附现象等优点。现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。三、实验器材1.电泳仪：为电泳提供直流电源。2.电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。3.血清加样器：可用盖玻片或X胶片或微量加样器。4.醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm5.其它：培养皿（直径9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。DYY-5型稳压稳流电泳仪DYY-Ⅲ型电泳槽四、实验试剂和材料1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH=8.6，离子强度0.075)：称取1.66g巴比妥和12.76g巴比妥钠,置于大烧杯

4、中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至1000ml。置4℃保存，备用。2、染色液：称取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水加至100ml。3、漂洗液：取无水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。3、0.4N氢氧化钠：称取氢氧化钠16.0g，蒸馏水加至1000ml1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中10-30分钟后，每组取醋酸纤维素薄膜1张，取时用竹镊子夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用它吸干表面液体。五、实验操作步骤（一）仪器与薄膜的准备2.电泳槽的准备点样

5、时，先在醋酸纤维薄膜的无光泽面距一端1.5cm处，预先用铅笔划一条线作为点样线，在缓冲液中浸泡10分钟后，用滤纸吸去多余的缓冲液，用点样器的边缘沾上血清后，在点样线上迅速地压一下，使血清通过点样器印吸在薄膜上，点样力求均匀。（见图）。此步是实验的关键。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）（二）点样：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电压为100伏，电泳时间1hr。电泳后，调节旋钮使电流为

6、零，关闭电泳仪切断电源。醋酸纤维薄膜电泳装置示意图1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板（三）电泳电泳完毕后将薄膜取下,直接浸于氨基黑10B的染色液中，染5min取出。将薄膜从染色液中取出后用水冲洗后，依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗，最后再用清水漂洗一遍，直至可清晰分辨出5条色带。取出薄膜放在滤纸上。血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图（四）染色与漂洗漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。（五）记录和分析实验结果六、注意

7、事项1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。附：4、定量1）取6支试管并编号，分别加入0.4N氢氧化钠4ml。2）剪下各条蛋白带和在膜空白部位剪一条带（空白带的宽度以最窄的

8、条带为准，why？），将各条带浸入试管，不时摇动，洗脱蓝色。3）光光度计比色，波长为650nm，以空白薄膜条