最新兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验教学讲义ppt.ppt

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1、兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验实验目的1.学习如何设计实验，训练学生独立设计并完成实验的能力。2.通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能，从牛血清中分离提取白蛋白，并鉴定。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质,约占总量的60%，牛血清白蛋白分子量约66.2kDa。它是一种水溶性很强的蛋白,结构稳定,能结合多种小分子,如脂肪酸,胆红素,血红素等,起维持血液的正常渗透压作用.白蛋白1.粗提盐析原理:<1>不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，逐渐改变硫酸铵浓度可分段

2、盐析出不同的蛋白。<2>影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。操作:<1>取0.5ml血清<2>取0.5ml饱和(NH４)２SO４溶液，缓慢滴入，边加边摇。<3>混匀后于室温中放置10分钟。<4>8000r/min×10min<5>小心吸取上清液备用，初步获得白蛋白。操作2.脱盐盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分，样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等

3、都要用到透析的技术。透析原理：通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。操作：新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三

4、分之一至一半的空间。在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。放入盛有蒸馏水的大烧杯中，磁子搅拌，于4℃透析过夜,按时更换透析液。检查透析效果：1％BaCl2检查(NH4)2SO43.纯化离子交换色谱是蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。原理：离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带有相反电荷的离子结合。当流动相中存在其他相反电荷的离子时，就与结合在固

5、定相交换基团上的反离子进行交换。得到纯化的白蛋白++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-0.02MNH4AC++++++蛋白样品---------++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-NH4+0.06-0.3MNH4AC--白蛋白，α、β球蛋白带负电阴离子交换剂三、纯化（阴离子交换层析）洗脱将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/LNH4Ac洗脱30ml。（去掉α、β-球蛋白）改用0.3mol/LNH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（纯化的白蛋白）再生：0.3mol/LNH4Ac20ml

6、，0.02mol/LNH4Ac40ml原理：蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH

7、=8.6)倒入电泳槽内，两槽缓冲液平衡至同一水平面。两电极槽各放入两层滤纸，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上，它们的作用是联系薄膜与两极缓冲液之间的中间“桥梁”。操作：点样端1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板1、润湿：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。2、点样：点样时，先用吸管将3微升血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约1-2

8、mm。注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。另外操作过程要防止指纹污染。3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放