兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验课件

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1、兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验XXX实验目的1.学习如何设计实验，训练学生独立设计并完成实验的能力。2.通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能，从牛血清中分离提取白蛋白，并鉴定。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质,约占总量的60%，牛血清白蛋白分子量约66.2kDa。它是一种水溶性很强的蛋白,结构稳定,能结合多种小分子,如脂肪酸,胆红素,血红素等,起维持血液的正常渗透压作用.白蛋白分离纯化的意义①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。②工业生产

2、的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。④基因工程的需要分离纯化的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。分离纯化的一般程序选择材料破碎细胞提取分离纯化

3、分析及鉴定（盐析，离子交换色谱）（电泳）（离心）透析原理：通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。操作：新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间。在袋内

4、放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。放入盛有蒸馏水的大烧杯中，磁子搅拌，于4℃透析过夜,按时更换透析液。检查透析效果：1％BaCl2检查(NH4)2SO43.纯化离子交换色谱是蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。原理：离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带有相反电荷的离子结合。当流动相中存在其他相反电荷的离子时，就与结合在固定相交换基团上的反离子进行交换。得到纯化的白蛋白++++++AC-AC-AC-A

5、C-AC-AC-0.02MNH4AC++++++蛋白样品---------++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-NH4+0.06-0.3MNH4AC--白蛋白，α、β球蛋白带负电阴离子交换剂三、纯化（阴离子交换层析）洗脱将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/LNH4Ac洗脱30ml。（去掉α、β-球蛋白）改用0.3mol/LNH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（纯化的白蛋白）再生：0.3mol/LNH4Ac20ml，0.02mol/LNH4Ac40ml原理：蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH

6、白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。白蛋白等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到白蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。四、醋酸纤维素薄膜电泳检查准备：制作电桥将巴比妥缓冲液(pH=8.6)倒入电泳槽内，两槽缓冲液平衡至同一水平面。两电极槽各放入两层滤纸，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上，它们的作用是联系薄膜与两极缓冲液之间的中间“桥梁”。操作：点样端1.

7、滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板1、润湿：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。2、点样：点样时，先用吸管将3微升血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约1-2mm。注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜