液相色谱基本原理ppt课件.ppt

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1、22液相色谱技术Chromatography背景色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HP

2、LC）等。色谱法的基本原理色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液22.1色谱的基本概念固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解

3、，交换等作用。流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。分配系数可由Langmuir方程得出Kd---分配系数q、c---溶质在固相和液相中的浓度保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.阻滞因子Rf阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准

4、物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小.洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。理论板，理论板当量高度（HETP），理论塔板数（N）、反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。理论板当量高度：该段色谱柱的高度。理论板数的计算方法N---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度理论塔

5、板高度：L---柱长22.2色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：按操作形式不同分类：柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用

6、的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。按分离的压力高压色谱中压色谱低压色谱按流动相分气相色谱液相色谱超临界流体色谱22.3各类色谱技术及应用凝胶过滤色谱离子交换色谱疏水色谱聚焦色谱反相色谱超临界流体色谱羟基磷灰石色谱灌注色谱应用凝胶过滤技术1)Gelfiltrationchromatography(GFC)原理操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子(a)，小分子扩散进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新

7、的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。分子筛色谱:从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。分子筛凝胶色谱原理分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt,组分1-2在V0-Vt之间.显然，GFC能分离洗脱体积在V0-Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离分配系数m影响因素：分子量,分子形状,gel孔径结构；与pH,I,T无关.2)凝胶介质

8、对介质的要求：1st亲水性高；2nd表面惰性，不发生化学和物理变化；3rd高稳定性，有较宽的pH和I适应范围；4th具有一定的孔径分布；5th机械强度高，耐高压操作，寿命长。商品化的介质均能满足1-4条的要求。介质的类型：1stSephadex2ndSephacryl3rdSuperose/-dex,Sepharose4thCellulose5thTSKgel凝胶介质特征参数排阻极限(exclusionlimit)：指不能扩散