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1、槐花中黄酮类化合物分离和鉴定［适用对象］中药国际交流、中药知识产权、中药制药工程、中药资源专业［实验学时］9一、实验目的要求学习黄酮类化合物的提取、分离和检识，通过实验要求:（1）了解沸水提取黄酮类化合物的原理和操作。（2）了解由芸香甘水解制取棚皮素的方法。（3）掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮昔、首元和糖部分的检识方法。二、实验原理由槐花中提取芸香甘的方法很多，本实验是根据芸香吾在冷水和热水中的溶解度差异的特性进行提取和精制。纸色谱的分离原理是利用各种化合物在流动相和固定相中分配系数的不同而达到分离目的。三、仪器设备烘箱、水浴锅、铁架台，烧杯，三角烧瓶，滤纸，试管，层析槽,毛细管
2、等。、相关知识点槐花为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花及花蕾，主要含芸香苜（芦丁），含量高达12〜20%,水解生成棚皮素、葡萄糖及鼠李糖。芸香昔（rutoside）,分子式C27H30O16,分子量610.51,淡黄色针状结晶，mp.l77-178°Co难溶于冷水（1:8000）,略溶于热水（1:200）,溶于热甲醇（1：7）,冷甲醇（1：100）,热乙醇（1：30）,冷乙醇（1:650）,难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醍、石油醍等，易溶于毗嚏及稀碱液中。梅I皮素（quercetin）,分子式CI5H
3、o07j分子量302.23,黄色针状结晶，mp.3
4、14°C（分解）。溶于热乙醇（1:23）,冷乙醇（1:300）,可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、毗嚏等，不溶于石油醍、苯、氯仿、乙醍中，儿不溶于水。HO0、O芸香昔R二瑞j萄糖-鼠李糖棚皮素R=H五、实验步骤（一）芸香昔、棚皮素和糖的纸色谱鉴定1、点样：取新华一号色谱滤纸，规格20cmX20cm,在滤纸下端约2cm处用铅笔画一直线，间隔2cm分别点上下列样品或标准溶液:（1）糖样品溶液（3）标准鼠李糖溶液（2）标准葡萄糖溶液（4）芸香昔样品甲醇溶液（5）芸香昔标准品溶液（6）棚皮素样品甲醇溶液（7）棚皮素标准品溶液2、展开剂：正丁醇-醋酸-水（4:1：5）上层上行展开。3、显色
5、：展开完毕，将滤纸取出,记录溶剂前沿位置。待溶剂挥尽后，在（3）与（4）点之间剪开，分别显色。（1）糖的显色：喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，在105°C烘10分钟,显棕色斑点。计算并比较样品和标准品的Rf值。（2）黄酮化合物的显色：%1可见光下观察色斑，紫外灯下观察荧光斑点。%1经氨气薰后再观察。%1待氨气挥尽后，喷1%A1C13甲醇溶液，再观察。%1计算并比较样品与标准品的Rf值。（二）芸香昔和棚皮素性质试验1、酸性试验：取小试管8支，每4支一组，第一组每管中加入芸香昔Img,第二组每管中加入概皮素Img,每组四管中分别加入稀氨水、5%碳酸氢钠水溶液、5%碳酸钠水溶液、1%氢氧化钠水溶
6、液各2ml,振摇后观察各管溶解情况。溶解的溶液应呈黄色。再加浓盐酸数滴酸化，黄色褪去或变浅，并有沉淀析出或产生混浊。2、Molish反应：取试样1mg置小试管中，加乙醇0.5ml溶解,加Q■禁酚试剂1〜2滴，摇匀。倾斜试管，沿管壁徐徐注入浓硫酸约0.5ml静置。观察两层溶液的界面变化，出现紫色环者为阳性，表示样品分子中含有糖的结构（糖和甘类均呈阳性反应），比较芸香昔和榭皮素的不同。3、Fehling试验：取试样数mg,溶于0.5ml热水中，加斐林氏试剂甲、乙等量混合液2ml,沸水浴上加热，如产生氧化亚铜的暗红色或黄色沉淀表示有还原糖或其它还原性物质。充分加热作用后滤去沉淀，滤液滴加
7、浓盐酸酸化，在水浴上加热水解，水解液以10%NaOH中和，再进行斐林氏试验，此时显阳性反应者表示样品为糖甘化合物。比较芸香甘和棚皮素的不同。4、盐酸-镁粉反应：取芸香甘1mg,加乙醇2ml,在水浴上加热溶解，加镁粉约50mg,滴加数滴浓盐酸，溶液由黄色渐变红色者表示有黄酮类化合物。以同法试验棚皮素。如用锌粉代替镁粉，则芸香甘（3-羟基与糖结合成首）仍有作用，而棚皮素（黄酮醇类）不呈还原显色反应。因此可区别两者。5、错-柠檬酸反应：取样品1mg,加甲醇2ml,在水浴上加热溶解,再加2%二氯氧错甲醇溶液3〜4滴，凡有3-羟基或5.羟基的黄酮即呈鲜黄色。然后加2%柠檬酸甲醇溶液3〜4滴，
8、有3-羟基的黄酮黄色不褪。比较芸香苜和懈皮素的不同。6、三氯化铝反应：取样品1mg溶于甲醇中，加1%三氯化铝甲醇溶液2〜3滴，黄酮类呈鲜黄色，并有荧光。六、实验报告要求应包括原理描述、实验流程、数据记录、解决问题的能力、实验结果、实验效果及建议等。七、思考题1、检识黄酮类化合物的常用化学方法有哪些？2、本实验中各种色谱的原理是什么？解释化合物结构与Rf值的关系。3、试讨论首类成分的检识程序。八、实验成绩评定方法本门实验课程考核成绩占课程总成绩的30%,该实验考核成绩占
